מיצוי נוגדני של כרומטין

מתוך ויקיפדיה, האנציקלופדיה החופשית
קפיצה אל: ניווט, חיפוש
מיצוי נוגדני של כרומטין

מיצוי נוגדני של כרומטיןאנגלית: Chromatin Immunoprecipitation‏; בראשי תיבות: ChIP) הוא שיטה המיישמת מיצוי נוגדני הבוחנת אינטראקציות בין חלבונים לחומצות גרעין בתאים. מטרת השיטה היא לזהות חלבונים מסוימים הבאים במגע עם אתרים מסוימים בגנום של התא, כגון פקטורי שעתוק הבאים במגע עם פרומוטורים, או אתרי קישור DNA אחרים, והגדרה של ציסטרומים (cistromes)‏[1] . כמו כן מיצוי נוגדני של כרומטין משמש לזיהוי אתרים ספציפיים בגנום שבהם בוצעו עריכות היסטונים (histone remodeling), ומציינים את אתרי המטרה של חלבונים עורכי היסטונים.[2]

בקצרה, השיטה מתבצעת כדלהלן: חלבונים וכרומטין נמצאים בקישור זמני במיצוי תאים, גדילי הDNA נחתכים ותלכיד החלבון – DNA הקשורים לחלבונים ספציפיים מושקעים על ידי שימוש בנוגדנים ספציפיים להם, גדילי DNA אלו מנוקים ונבדקים ולעתים מרוצפים. ניתן להסיק שרצפי DNA אלו באים במגע עם החלבון הנבדק בתוך התא (in vivo).

מיצוי נוגדני של כרומטין טיפוסי[עריכת קוד מקור | עריכה]

ישנן שתי שיטות עיקריות של מיצוי נוגדני של כרומטין, והשלב השונה ביניהן הוא הכנת מיצוי התאים וצורת חיתוך גדילי הDNA. הראשונה משתמשת בטכניקת הצלבה הפיכה וחיתוך גדילי הDNA באמצעות סונקציה ונקראת מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע מוצלב ( (XChIP. בעוד השיטה השנייה אינה מבצעת הצלבה ובה חיתוך הDNA מבוצע באמצעות אנזימים המעכלים DNA המופקים מחיידקי המיקרוקוס.

מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע מוצלב (XChIP)[עריכת קוד מקור | עריכה]

מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע מוצלב היא שיטה למפות אתרי קישור של פקטורי שעתוק, וחלבונים קושרי כרומטין אחרים על גבי הDNA. חומרי המוצא שלו הוא מיצוי תאים שעבר קיבוע הצלבה הפיך. קיבוע זה נעשה באמצעות פורמלדהיד[3] או קרינה אולטרה סגולית (UV)[4].

תיאור השיטה[עריכת קוד מקור | עריכה]

מצוי תאים עובר תהליך של קיבוע הצלבה הפיכה באחת השיטות המוזכרות לעיל. לאחר קיבוע ההצלבה גדילי הDNA מפורקים בדרך כלל על ידי סונקציה, תהליך המותיר שברים באורך של בין 300-1000 בסיסים חנקניים. שברים באורכים של בין 400-500 בסיסים מתאימים ביותר לזיהוי מוטיבים של קישור מאחר שהם באורך קורלטיבי למספר נוקלאוזומים בודד ומאפשרים הסקה של קישור על פי מבנה מרחבי. שאר מיצוי התא מופרד מהתמיסה בהשקעה, ותלכידי חלבון-DNA מושקעים בהשקעה באמצעות נוגדנים ספציפיים לחלבון הנבדק. נוגדנים אלו בדרך כלל מחוברים לחומר המאפשר הפרדה פשוטה, כגון : אגרוז, ספרוז או חלקיקים מגנטיים. התלכיד נוגדני המושקע (ז"א, החלקיק-הנוגדן-חלבון המטרה-הDNA) נאספים ונשטפים על מנת להפריד כרומטין שנקשר בצורה לא ספציפית. תלכידים אלו מעוכלים בפרוטאז K , על מנת לשחרר את הDNA להמשך אבחון. גרסאות מתויגות של החלבון הנבדק או ביוטינילציה [5] של החלבון יכולים לשמש במקום נוגדנים ספציפיים לחלבון ולאפשר להפרידו ביעילות גבוהה ובעלות נמוכה משעולה לייצר נוגדן חד שבטי. ניתן לזהות את גדיל הDNA שהופרד מהתלכיד במספר שיטות, כגון : ריאקציית PCR , שבב, ריצוף מולקולרי, ריצוף מהיר-עיבוד.

מיצוי נוגדני של כרומטין בתנאים טבעיים (NChIP)[עריכת קוד מקור | עריכה]

שיטה זו בעיקר משמשת למיפוי אתרי מטרה של חלבונים עורכי היסטונים. חומר המוצא הוא מיצוי תאים טבעי ללא טיפולים. הDNA במצבו הטבעי מלופף סביב ההיסטונים ליצירת הנוקלוזומים. חותכים את הDNA באמצעות אנזימים המעכלים DNA המופקים מחיידקי המיקרוקוס, אשר חותכים DNA בין הנוקלאוזומים ומשאירים את הנוקלוזומים שלמים, חלקי הDNA נעים באורכים בין 200 בסיסים (נוקלואוזם בודד), עד לכ1000 בסיסים (חמישה נוקלוזומים). שאר הטכניקה זהה למה שתואר במיצוי מוצלב (XChIP) , בנוגע לניקוי, מיצוי, הפקה ואנליזה של DNA מופרד.

השוואה בין שתי שיטות המיצוי[עריכת קוד מקור | עריכה]

היתרון העיקרי בתנאים טבעיים הוא הספציפיות של הנוגדנים. חשוב להבין שנוגדנים הספציפיים להיסטונים ערוכים, הם ספציפיים לעריכות קטנות בחלבון, בעוד לאחר הקיבוע המוצלב בפורמלדהיד הקיבוע פוגע במבנה החלבונים ופוגע במבנה של אתרי המטרה של הנוגדנים בחלבונים אלו. זה גם מסביר את היעילות הנמוכה של מיצוי נוגדנים בקיבוע מוצלב לעומת בתנאים טבעיים. אך המטרות של שתי השיטות הן שונות כך שהיתרונות של שיטה אחת על האחרת הם יחסיים. קיבוע מוצלב משמש לזיהוי אתרי פעילות של פקטורי שעתוק וחלבונים קושרי כרומטין אחרים, בעוד מיצוי בתנאים טבעיים בוחן עריכות להיסטונים (ראה טבלה 1).

טבלה 1 הייתרונות והחסרונות של מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע מוצלב ובתנאים טבעיים

מיצוי בקיבוע מוצלב מיצוי בתנאים טבעיים
יתרונות
  • מתאים לפקטורי שעתוק, וכל חלבון בעל אינטראקציות חלשות עם כרומטין.
  • יישם בכל אורגניזם כאשר חלבונים בתנאים טבעיים קשים למיצוי.
  • יכולת קישור יותר טובה וספציפיות יותר טובה של נוגדני המיצוי.
  • הפקה גדולה יותר של כרומטין, הנובעת מהספציפיות הרבה יותר של הנוגדנים.
חסרונות
  • מיצוי פחות של כרומטין עקב פגיעה באתרי הקישור של הנוגדנים.
  • יכול לתת תשובה שגוייה כאשר יש קיבוע של חלבונים חולפים לכרומטין.
  • מקטעי DNA בגדלים שונים עקב החיתוך האקראי של הDNA.
  • אינו יעיל על חלבונים מלבד היסטונים מאחר שהוא מחייב חלבונים בעלי קישור חזק לDNA‏.
  • לעתים נוקלאוזומים משתנים במהלך החיתוך.

ההיסטוריה של טכניקות מיצוי נוגדני של כרומטין[עריכת קוד מקור | עריכה]

בשנת 1984 ג'ון ליס (John T. Lis) וחוקר במעבדתו דוד גילמור (David Gilmour), השתמשו בקרינה אולטרה סגולית על מנת לעשות קיבוע מוצלב של חלבונים לDNA בתאי חיידקים חיים. לאחר מיצוי תכולת התאים הם השקיעו באמצעות נוגדנים כנגד RNA פולימראז חיידקי, את הDNA שהושקע הם בדקו עם גלאים לאזורים שונים בגנום החיידק כדי לזהות פיזור וצפיפות של RNA פולימראז באזורי הגנים השונים. ב-1985 הם השתמשו באותה השיטה רק הפעם לבדיקת RNA פולימראז 2 באוקריוים בתאי זבוב הפירות, ובדיקה של גלאים של גני עקת חום. עבודות אלו מוגדרות כפריצות הדרך של עבודה עם מיצוי נוגדני של כרומטין.[6][7] מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע מוצלב שופר ופותח על ידי אלכסנדר ורשבסקי (Alexander Varshavsky) ושותפים, שבדקו את הנוכחות של היסטון H4 על גני עקת חום, במקום להשתמש בקרינה אולטרה סגולית הם השתמשו בפורמלדהיד על מנת לקבע[8][9]. טכניקות אלו שופרו ופותחו מאוד מאז[10]. מיצוי נוגדני של כרומטין בתנאים טבעיים (NChIP) תואר לראשונה על ידי מעבדתו של הביס (Hebbes) ב-1988[11], וגם שיטה זו פותח ושופרה רבות לשימוש נפוץ[12]. שיטת המיצוי המקורית לוקחת כ 4-5 ימים ודורשת כ106- 107 תאים. שיטות חדשות מאפשרות לבצע את התהליך תוך יום אחד ודורשות הרבה פחות תאים כ100-1000.

מיצוי נוגדני של כרומטין באמצעות נשא - (Carrier ChIP (CChIP[עריכת קוד מקור | עריכה]

שיטה זו יכולה להיות יעילה גם בשימוש של רק כ100 תאים, על ידי הוספה של תאי זבוב פירות (Drosophila) ככרומטין נשא, ובכך להפחית את אובדן הכרומטין הנבדק בהשקעה, על ידי הטיית שיווי המשקל של ההשקעה. אך כמובן הוא דורש גלאים ספציפיים שיוכלו לזהות את הDNA הנבדק על גבי הרקע של הכרומטין הנשא, שיטה זו לוקחת כיומיים שלושה.[13]

מיצוי מהיר נוגדני של כרומטין - (Fast ChIP (qChIP[עריכת קוד מקור | עריכה]

שיטה זו מאיצה את התהליך על ידי האצה של שני שלבים במהלך המיצוי : 1. אמבט אולטראסוני מאיץ את תהליך הקשירה של הנוגדנים לחלבוני המטרה ובכך מאיץ את תהליך ההשקעה. 2. פרוטוקול מבוסס שרף (Chelex-100) להפרדת DNA מקצר את הפקת הDNA והיפוך הקיבוע המוצלב. הניצולת של תהליך זה אינה גבוהה ולכן צריך תמצית תאים המופקת מכמות תאים רבה (כ106~ 107)[14][15]. ניתן לייצר באמצעות שיטה זו עד 24 מקטעי DNA מוכנים לPCR בתוך 5 שעות, שיטה זו מאפשרת בדיקה של פעילות מספר פקטורי שעתוק בו זמנית ולהסתכל על שינויים באוכלוסיות תאים לאורך זמן[16].

מיצוי נוגדני של כרומטין מהיר וכמותי (Quick and quantitative ChIP (Q2ChIP[עריכת קוד מקור | עריכה]

שיטה זו משתמשת בחומר מוצא מיצוי של 105 תאים, ומאפשרת בדיקה של 1000 היסטונים או 100 פקטורי שעתוק. בשיטה זו דוגמאות כרומטין רבות יכולות להיות מוכנות במקביל ולהיבדק במקביל. אורך הבדיקה הוא כיום[17] .

מיקרו מיצוי נוגדני של כרומטין (MicroChIP (µChIP[עריכת קוד מקור | עריכה]

שיטה זו בדרך כלל משתמשת במיצוי מכ1000 תאים, ומאפשרת לבצע 8 תהליכי מיצוי ללא שימוש בנשא. שיטה זה יכולה להיעשות גם ממיצוי 100 תאים בלבד אך תהליך מיצוי בודד. כמו כן ניתן להשתמש ברקמת ביופסיה של 1 ממ3 . שיטה זו מבוצעת תוך יום אחד[18][19].

מיצוי נוגדני של כרומטין במיקרו-פלטה - Matrix ChIP[עריכת קוד מקור | עריכה]

שיטה זו מאפשרת רמה גבוהה יותר של עבוד ומפשטת את התהליך, כל תהליך מבוצע במיקרו-פלטה ומאפשר את הפוטנציאל של אוטומציה. בתהליך זה ניתן לעשות 96 מיצויים במקביל, וכל התהליך לוקח יום בודד[20].

מיצוי נוגדני של כרומטין נעשה גם על גנום שלם באמצעות טכנולוגיית "מיצוי נוגדני של כרומטין על שבב" (ChIP-on-chip) או טכנולוגיית ריצוף DNA חדשניות (Chip-Sequencing). כמו כן ניתן לשלב שיטה זו עם טכניקת "ריצוף קצוות מזווגים מתויגים" (paired end tags sequencing) בשיטה הנקראת "בחינת אינטראקציות כרומטין באמצעות ריצוף קצוות מזווגים" Chromatin Interaction Analysis using Paired End Tag sequencing (ChIA-PET), שיטה שנועדה לבחינה של אינטראקציות של כרומטין במבנה מרחבי של יצורים אוקריוטים[21][22][23].

הגבלות של מיצוי נוגדני של כרומטין[עריכת קוד מקור | עריכה]

  • בדיקה רחבת טווח באמצעות מיצוי נוגדני של כרומטין היא מאתגרת. מאחר שצריך ליצור נוגדן ספציפי לכל פקטור שעתוק, או אורגניזם מהונדס המכיל פקטורי שעתוק מתויגים.
  • חקר דוגמאות ביטוי בשיטה זו מהווה בעיה מאחר שישנם שינויים בביטוי בתאים מסוימים בתנאים שונים לחלונות זמן מאוד קטנים.
  • שיטות אלו מתקשות בהבדלה בין איזופומים שונים של פקטורי שעתוק.

ראו גם[עריכת קוד מקור | עריכה]

  • RIP-Chip שיטה דומה המנתחת אינטראקציות בין חלבונים ל-RNA
  • DamID שיטה חלופית שאינה דורשת ייצור של נוגדנים ספציפיים
  • ChIP-exo שיטה המוסיפה נוקלאזות לתהליך ומקטינה את תוצרי ההפקה למקטעים הקושרים.
  • ChIP-on-chip שילוב של שיטת המיצוי עם טכנולוגיית המעבדה על שבב.

קישורים חיצוניים[עריכת קוד מקור | עריכה]

הערות שוליים[עריכת קוד מקור | עריכה]

  1. ^ Liu, Tao. (2011). "Cistrome: an integrative platform for transcriptional regulation studies". Genome Biology 12 (8): R83. doi:0.1186/gb-2011-12-8-r83. PMID 21859476. 
  2. ^ Collas, Philippe. (January 2010). "The Current State of Chromatin Immunoprecipitation". Molecular Biotechnology 45 (1): 87–100. doi:10.1007/s12033-009-9239-8. PMID 20077036. 
  3. ^ Jackson, Vaughn (November 1978). "Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent". Cell 15 (3): 945–54. doi:10.1016/0092-8674(78)90278-7. PMID 569554. אוחזר ב־2010-03-13. 
  4. ^ Gilmour DS, Lis JT (August 1985). "In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster". Molecular and Cellular Biology 5 (8): 2009–18. PMID 3018544. PMC:366919. אוחזר ב־2010-03-13. 
  5. ^ Viens A et al. "Use of protein biotinylation in vivo for chromatin immunoprecipitation" (2004) Analytical Biochemistry 325(1):68-76 [1]
  6. ^ Detecting protein-DNA interactions ... [Proc Natl Acad Sci U S A. 1984] - PubMed - NCBI
  7. ^ In vivo interactions of RNA polymerase II with... [Mol Cell Biol. 1985] - PubMed - NCBI
  8. ^ Varshavsky A (December 2008). "Discovery of cellular regulation by protein degradation". Journal of Biological Chemistry 283 (50): 34469–89. doi:10.1074/jbc.X800009200. PMID 18708349. אוחזר ב־2010-03-06. 
  9. ^ Solomon, Mark J; Larsen Pamela L; Varshavsky, Alexander. (June 1988). "Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene". Cell 53 (6): 937–47. doi:10.1016/S0092-8674(88)90469-2. PMID 2454748. אוחזר ב־2010-03-06. 
  10. ^ Orlando V (March 2000). "Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation". Trends in Biochemical Sciences 25 (3): 99–104. doi:10.1016/S0968-0004(99)01535-2. PMID 10694875. אוחזר ב־2010-03-14. 
  11. ^ Hebbes, Tim R; Thorne, Alan W; Crane-Robinson C. (May 1988). "A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin". The EMBO Journal 7 (5): 1395–402. PMID 3409869. אוחזר ב־2010-03-06. 
  12. ^ O'Neill, Laura P; Turner, Bryan M (September 2003). "Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP". Methods (San Diego, Calif.) 31 (1): 76–82. doi:10.1016/S1046-2023(03)00090-2. PMID 12893176. אוחזר ב־2010-03-14. 
  13. ^ O'Neill, Laura P; VerMilyea, Matthew D; Turner, Bryan M (July 2006). "Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations". Nature Genetics 38 (7): 835–41. doi:10.1038/ng1820. PMID 16767102. אוחזר ב־2010-03-14. 
  14. ^ Nelson, Joel D; Denisenko, Oleg; Sova, Pavel; Bomsztyk, Karol (2006). "Fast chromatin immunoprecipitation assay". Nucleic Acids Research 34 (1): e2. doi:10.1093/nar/gnj004. PMID 16397291. אוחזר ב־2010-03-14. 
  15. ^ Nelson, Joel D; Denisenko, Oleg; Bomsztyk, Karol (2006). "Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method". Nature Protocols 1 (1): 179–85. doi:10.1038/nprot.2006.27. PMID 17406230. אוחזר ב־2010-03-14. 
  16. ^ Nelson J, Denisenko O, Bomsztyk K (2009). "The fast chromatin immunoprecipitation method". Methods in Molecular Biology 567: 45–57. doi:10.1007/978-1-60327-414-2_3. PMID 19588084. אוחזר ב־2010-03-14. 
  17. ^ Dahl, John Arne; Collas, Philippe (April 2007). "Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells". Stem Cells 25 (4): 1037–46. doi:10.1634/stemcells.2006-0430. PMID 17272500. אוחזר ב־2010-03-14. 
  18. ^ Dahl, John Arne; Collas, Philippe (2008). "A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP)". Nature Protocols 3 (6): 1032–45. doi:10.1038/nprot.2008.68. PMID 18536650. אוחזר ב־2010-03-14. 
  19. ^ Dahl, John Arne; Collas, Philippe (2009). "MicroChIP: chromatin immunoprecipitation for small cell numbers". Methods in Molecular Biology 567: 59–74. doi:10.1007/978-1-60327-414-2_4. PMID 19588085. אוחזר ב־2010-03-14. 
  20. ^ Flanagin, Steve ; Nelson, Joel D; Castner, David G; Denisenko, Oleg; Bomsztyk, Karol (February 2008). "Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events". Nucleic Acids Research 36 (3): e17. doi:10.1093/nar/gkn001. PMID 18203739. אוחזר ב־2010-03-14. 
  21. ^ Fullwood, Melissa J; Han, Yuyuan; Wei, Chia-Lin; Ruan, Xiaoan; Ruan, Yijun (January 2010). "Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing". Current Protocols in Molecular Biology Chapter 21: Unit 21.15.1–25. doi:10.1002/0471142727.mb2115s89. PMID 20069536. אוחזר ב־2010-03-14. 
  22. ^ Li, Guoliang; Fullwood, Melissa J; Xu, Han; Mulawadi, Fabianus Hendriyan; Velkov, Stoyan; Vega, Vinsensius; Ariyaratne, Pramila Nuwantha; Mohamed, Yusoff Bin; Ooi, Hong-Sain; Tennakoon, Chandana; Wei, Chia-Lin; Ruan, Yijun; Sung, Wing-Kin (February 2010). "ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing". Genome Biology 11 (2): R22. doi:10.1186/gb-2010-11-2-r22. PMID 20181287. אוחזר ב־2010-03-14. 
  23. ^ ChIA-PET: Novel Method For 3-D Whole Genome Mapping Research. ScienceDaily. Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore. (2009-11-08). אוחזר ב־14 March 2010.