DNA רקומביננטי

דנ"א רקומביננטי (Recombinant DNA) - הינו מולקולת DNA שנוצרה באופן טבעי או תוכננה במעבדה - כתוצאה מצירוף (קומבינציה) מחדש (רה) של מקטעי DNA ממקורות שונים, לרוב ממינים שונים של אורגניזמים.

מולקולות דנ"א רקומביננטי (rDNA) הנן מולקולות דנ"א המיוצרות לרוב בשיטות מעבדה של התערבות גנטית (כמו שיבוט מולקולרי), על מנת לחבר חומר גנטי ממספר מקורות שונים, ויצירת רצפים גנטים אשר לא היו יכולים להתקיים ביצורים חיים ללא התערבות זו. דנ"א קרומביננטי אפשרי כיוון שמולקולות דנ"א מכל היצורים חולקות את אותו המבנה הכימי ושונות רק ברצף הנוקלאוטידי אשר נמצא בתוך המבנה הכללי הזהה.

הקדמה

דנ"א רקומביננטי הנו שם כללי לתוצר התהליך בו לוקחים חלק אחד של דנ"א ומשלבים אותו עם שרשרת נוספת של דנ"א. מולקולות דנ"א רקומביננטי לפעמיםם נקראות "דנ:T כימרי", כיוון שהן לרוב עשויות מחומר גנטי של שני יצורים שונים. טכנולוגית הדנ"א הרקומביננטי משתמשת ברצפים פלינדרומים.

רצפי הדנ"א המשמשים לבניית דנ"א רקומביננטי יכולים להיות במקורם מכל יצור או זן. לדוגמא, דנ"א צמחי יכול להצטרף לדנ"א של בקטריה, או למשל דנ"א אנושי יכול להצטרף לדנ"א של פטרייה. בנוסף, רצפי דנ"א שלא קיימים בשום מקום בטבע יכולים להיווצר ע"י הסינתזה הכימית של דנ"א, ולהישתלב יחד לדנ"א רקומביננטי.

שימוש בטכנולוגית דנ"א רקומביננטי ובדנ"א סינטטי, למעשה אומר כי כל רצף של דנ"א יכול להיווצר ולהיות מוצג לכל אחד ממגוון רחב מאוד של יצורים חיים.

חלבונים אשר נוצרים כתוצאה מהופעת הדנ"א הרקומביננטי שבתוך התאים, נקראים חלבונים רקומביננטים. כאשר דנ"א רקומביננטי המקודד חלבון מוצג לייצור המארח, החלבון הרקומביננטי לא תמיד יווצר. הווצרות חלבונים כתוצאה מביטוי לחלבונים זרים דורש שימוש בוקטורי ביטוי מיוחדים ולעתים קרובות על גוף היצור לעשות ארגון מחדש של הרצף הגנטי שלו על מנת לייצר את החלבון הזר.

דנ"א רקומביננטי שונה משילוב גנטי בכך שהאחרון משתמש בשיטות מלאכותיות בתוך מבחנה, בעוד שדנ"א רקומביננטי הוא תהליך ביולוגי המתבסס על שילוב של דנ"א הקיים באופן טבעי אצל יצורים חיים.

יצירת דנ"א רקומביננטי

שיבוט מולקורלרי הינו תהליך מעבדה שבו משתמשים על מנת ליצור דנ"א רקומביננטי. שיטה זו הינה אחת ממגוון שיטות קיימות, כמו תגובת השרשרת של פולימראז (PCR) המשמשת לבקר את השכפול של כל רצף DNA ספציפי. השוני העיקרי בין שתי השיטות הללו הינו ששיבוט מולקולרי כולל שכפול של הדנ"א בתוך תא חי, בעו ש-PCR משכפל דנ"א במבחנה, ללא תאים חיים.

ייצור של דנ"א רקומביננטי דורש וקטור שיבוט, מולקולת דנ"א אשר משתכפלת בתוך תא חי. וקטורים לרוב נגזרים מפלסמידים או מוירוסים, ומייצגים יחסית חלק קטן של דנ"א הכולל אותות נחוצים לשכפול גנטי, כמו גם אלמנטים נוספים המאפשרים החדרת דנ"א זר. בחירת הוקטור לשיבוט המולקולרי תלוי בבחירת הייצור המארח, גודל הדנ"א המשובט, והאם ואיך על הדנ"א הזר להתבטא. חלקי הדנ"א יכולים להיות משולבים על ידי שימוש במגוון שיטות, כמו הגבלת האנזים או "הרכבת גיבסון".

בפרוטוקולים סטנדרטיים של שיבוט, השיבוט של כל קטע DNA כרוך בשבעה צעדים: 1. בחירה של יצור מארח ווקטור שיבוט 2. הכנת וקטור הדנ"א 3. הכנת הדנ"א למצב של שיבוט 4. יצירת דנ"א רקומביננטי 5. הצגה של הדנ"א הרקומביננטי לייצור המארח 6. בחירה של יצורים המכילים דנ"א רקומביננטי 7. סריקת השיבוטים עם ה- DNA רצוי והמאפיינים ביולוגיים.

ביטוי של דנ"א רקומביננטי

לאחר השתלה לתוך האורגניזם המארח, הדנ"א הזר המוכל בתוך ה- DNA הרקומביננטי עשוי או עשוי שלא, לבוא לידי ביטוי. ייתכן כי הדנ"א פשוט ישוכפל ללא ביטוי, או שהוא יעובד ויתורגם כך שהחלבון הרקומביננטי יווצר. באופן כללי, ביטוי של גן זר דורש בנייה מחדש של הגן, כך שיכלול רצפים הדרושים לייצור מולקולת mRNA היכולה להיות בשימוש על ידי מנגנון התרגום של המארח. שינויים ספציפים לאורגניזם המארח יכולים להיעשות על מנת לשפר את הביטוי של הגן. בנוסף, ייתכן כי יתבצעו שינויים נוספים לרצף קידוד, על מנת לשפר את התרגום, להפוך את החלבון למסיס, לכוון את החלבון רקומביננטי למיקום התאי/ החוץ תאי הנכון ולייצב את החלבון.

מאפייני אורגניזמים המכילים דנ"א רקומביננטי

ברוב המקרים, לאורגניזמים הכוללים דנ"א רקומביננטי יש פנוטיפים רגילים. כלומר, ההופעה שלהם, ההתנהגות והמטבוליזם לרוב לא משתנים, והדרך היחידה להראות את קיומו של הדנ"א הרקומביננטי הוא לבדוק את הדנ"א עצמו, לרוב ע"י בדיקת PCR. קיימים יוצאי דופן, להסבר - ראה מטה.

אם רצפי ה-rDNA מקודדים גן, אז הופעת ה-RNA או החלבון המיוצרים ע"י הגן הרקומביננטי, ניתנים לאיתור בדרך כלל באמצעות RT-PCR או שיטות נוספות. שינויים פנוטיפים משמעותיים הם יוצאי דופן, אלא אם הגן הרקומביננטי נבחר וקודד על מנת לגרום לפעילות ביולוגית בתא המארח. פנוטיפים נוספים כוללים רעילות לאורגניזם המארח, במיוחד אם הוא מבוטא בתוך תאים או רקמות לא תואמים.

בחלק מהמקרים, לדנ"א רקומביננטי יש השפעות מזיקות גם אם זה לא בא לידי ביטוי. מנגנון אחד שבו זה קורה הוא הכנסת אי-אקטיבציה insertional, שבו rDNA מוכנס לתוך הגן של התא המארח. בחלק מן המקרים, חוקרים משתמשים בתופעה הזו כדי "לשכנע" את הגנים להחליט מהו התפקיד הביולוגי שלהם וחשיבותם. מנגנון נוסף שבו הכנסת rDNA לתוך DNA כרומוזומי יכול להשפיע על ביטוי גנטי הוא ע"י הפעלה בלתי מתאימה של גנים בתאים קודמים שאינם מבוטאים. מנגנון זה יכול להתרחש, למשל, כאשר חלק של DNA רקומביננטי הכולל יוזם פעיל ממוקם לצד גן תא מארח שקט, או כאשר גן התא המארח הפועל כדי לרסן את הביטוי הגנטי, עובר תהליך של אי-אקטיבציה על ידי ה- DNA הרקומביננטי.

שימושי טכנולוגית דנ"א רקומביננטי

דנ"א רקומביננטי נמצא בשימוש רחב בביוטכנולוגיה, ברפואה ובמחקר. כיום, חלבונים רקומביננטים ותוצרים אחרים של דנ"א רקומביננטי נמצאים כמעט בכל בית מרקחת, מעבדת מחקר או מעבדה רפואית. בנוסף, אורגניזמים אשר עברו טיפולים בשימוש דנ"א רקומביננטי, וכן תוצרים שנגזרו מן היצורים הללו, מצאו את דרכם לחוות, לסופרמרקטים, לחנויות טבע ואפילו לחנויות לבעלי חיים.

השימוש הנפוץ ביותר של דנ"א רקומביננטי הוא במחקר בסיסי, בו הטכנולוגיה הזו חשובה לעבודה היומיומית העדכנית בביולוגיה ובביו-רפואה. דנ"א רקומביננטי משמש לזיהוי, מיפוי וסידור גנטי, וכן כדי להחליט על התפקוד הגנטי. בדיקות דנ"א רקומביננטי משמשות גם לניתוח הביטוי הגנטי בתאים ספציפים, וכן ברקמות שונות של אורגניזמים. חלבונים רקומביננטים משמשים באופן נרחב כמגיבים בניסויי מעבדה, כמי שמסייעים בבדיקות נוגדנים וכבסיס לבדיקת סינתזת חלבונים בתוך התאים.

כימוזין רקומביננטי

נמצא ברנט, כימוזין הוא אנזים הדרוש לייצור גבינה. זה היה המאכל המהונדס הגנטי הראשון שהיווה תוסף בשימוש מסחרי. באופן מסורתי, נוהגים לייצר כימוזין מרנט, אשר נגזר מהחלב. מדענים הינדסו שרשרת לא פאתוגנית (K12) של בקטריית אי-קולי בשביל ייצור מעבדה נרחב של האנזים. המיקרוביולוגיה הזו ייוצר אנזים רקומביננטי, בעל זהות מבנית לאנזים העגל, עולה פחות, ומיוצרת בכמויות נרחבות. כיום, בערך 60 אחוז מהגבינות הקשות בארה"ב מיוצרות עם כימוזין מהונדס גנטית. ב-1990, הFDA הגדיר את הכימוזין בסטטוס -"באופן כללי מוכר כבטוח", בהתבססות על מידע שהראה כי האנזים בטוח לשימוש. Recombinant chymosin Found in rennet, chymosin is an enzyme required to manufacture cheese. It was the first genetically engineered food additive used commercially. Traditionally, processors obtained chymosin from rennet, a preparation derived from the fourth stomach of milk-fed calves. Scientists engineered a non-pathogenic strain (K-12) of E. coli bacteria for large-scale laboratory production of the enzyme. This microbiologically produced recombinant enzyme, identical structurally to the calf derived enzyme, costs less and is produced in abundant quantities. Today about 60% of U.S. hard cheese is made with genetically engineered chymosin. In 1990, FDA granted chymosin "generally-recognized-as-safe" (GRAS) status based on data showing that the enzyme was safe.[11] Recombinant human insulin Almost completely replaced insulin obtained from animal sources (e.g. pigs and cattle) for the treatment of insulin-dependent diabetes. A variety of different recombinant insulin preparations are in widespread use.[12] Recombinant insulin is synthesized by inserting the human insulin gene into E. coli, or yeast (saccharomyces cerevisiae)[13] which then produces insulin for human use.[14] Recombinant human growth hormone (HGH, somatotropin) Administered to patients whose pituitary glands generate insufficient quantities to support normal growth and development. Before recombinant HGH became available, HGH for therapeutic use was obtained from pituitary glands of cadavers. This unsafe practice led to some patients developing Creutzfeldt–Jakob disease. Recombinant HGH eliminated this problem, and is now used therapeutically.[15] It has also been misused as a performance enhancing drug by athletes and others.[16] DrugBank entry