מעצם

מתוך ויקיפדיה, האנציקלופדיה החופשית
קפיצה לניווט קפיצה לחיפוש

מַעֲצֵםאנגלית: Enhancer) הוא מקטע DNA קצר, המשמש להגברת תיעתוק של גנים באופן ספציפי לסוג התא ולזמן ההתפתחותי. המעצם בדרך כלל אינו ממוקם בסמוך לגן המטרה שלו, ולכן על מנת שיוכל לפעול, הכרומטין (ה-DNA והחלבונים העוטפים אותו) מתקפל כך שהמעצם יגיע לסביבת הקדם (פרומוטור) של גן המטרה. המעצם אינו מתאפיין ברצף נוקלאוטידים ספציפי המבדיל בינו לבין אלמנטים אחרים בגנום, אלא על ידי שינויים אפיגנטיים (מודיפיקאציות). שינויים אלה מאפשרים יצירת זמינות (פתיחת) הכרומטין באזור המעצם וקישור של גורמי תיעתוק שמסייעים בבקרת התיעתוק של גן המטרה.

היסטוריה[עריכת קוד מקור | עריכה]

המעצם הראשון בבני אדם התגלה בשנות ה-80 של המאה ה-20 בעת המחקר של בקרת משפחת גני הגלובין בחולת בטא-תלסמיה[1]. בטא-תלסמיה היא מחלה תורשתית רצסיבית הנגרמת כתוצאה ממוטציות בגן המקודד לחלבון בטא-גלובין, המובילה לייצור מופחת של השרשרת החלבונית מסוג בטא - אחת משתי השרשראות החלבוניות (אלפא ובטא) המרכיבות את חלבון ההמוגלובין. החולים בבטא-תלסמיה סובלים מפגיעה בתאי הדם האדומים ובנשיאת החמצן אל תאי הגוף. בשנת 1989 תוארה חולת בטא-תלסמיה אשר נולדה להורים שלא נושאים את המוטציות בגן הבטא-גלובין, ממצא המצביע על כך שהחולה נושאת מוטציה חדשה (de-novo mutation). אנליזה שהתבצעה על הגנום של החולה חשפה חֶֶֶֶסר של מקטע DNA הממוקם לפני (בכיוון '5), אך לא בסמיכות, לגן הבטא-גלובין, ולכל משפחת גני הבטא גלובין. הירידה בייצור בטא-גלובין וכל הגנים ממשפחת הבטא גלובין (אפסילון, גמא ודלתא) והופעת תסמיני המחלה הובילו להבנה, שמקטע ה-DNA החסר משמש כאזור בקרה, והוא מעודד את התיעתוק של הגן המקודד לבטא-גלובין. כיוון שהמקטע היה מעורב בביטוי משפחת גני הגלובין ובקביעת התזמון של ביטויים במהלך ההתפתחות העוברית הוא זכה לכינוי locus control region ומאוחר יותר – מעצם על (super enhancer)[2].

מאפיינים[עריכת קוד מקור | עריכה]

שינויים אפיגנטיים[עריכת קוד מקור | עריכה]

מודיפיקציות אפיגנטיות המאפיינות מעצמים

מעצמים אינם מכילים רצף הסכמה ייחודי המבדיל בינם לבין אזורי בקרה אחרים או אזורים מקודדים, ולכן לעיתים קיים קושי לזהותם. עם זאת, קיימים מספר שינויים (מודיפיקאציות) אפיגנטיים שעשויים להעיד על כך שרצף DNA מסוים מתפקד כמעצם[3] . ראשית, על מנת שרצף DNA יוכל לשמש כמעצם הוא מוכרח להיות נגיש לקישור של גורמי תיעתוק, ולכן הכרומטין באזור הרצף צריך להיות פתוח. בנוסף, הוספת מודיפיקאציות על גבי חלבוני היסטון הסמוכים לרצף עשויות להצביע גם הן על כך שהרצף מתפקד כמעצם. למשל, הסבירות לכך שמקטע DNA מתפקד כמעצם פעיל עולה, אם קיימת קבוצת אצטיל על החומצה האמינית ליזין בעמדה ה-27 על היסטון 3 (H3K27ac)[3],[4]. המודיפיקאציות הן דינאמיות, ומקטע ששימש כמעצם יכול לחדול מלתפקד כמעצם על ידי שינוי המודיפיקאציות האפיגנטיות שלו. לדוגמה, סגירת הכרומטין באזור או החלפת קבוצת האצטיל בשלוש קבוצות מתיל (H3K27me3) מעידה שהרצף אינו מתפקד כמעצם[5][3].

מיקום[עריכת קוד מקור | עריכה]

גן בעל 3 מעצמים הרחוקים ממנו על רצף ה-דנ"א. על מנת שהמעצם יוכל להעצים את גן המטרה נדרשת קרבה פיזית בינו לבין הקדם. כל מעצם פועל ברקמה שונה ומביא לתיעתוק הגן רק ברקמה בה הוא פועל.

בשונה מהקדם (פרומוטור) הממוקם בסמיכות ולפני גן המטרה (בכיוון '5), המעצם יכול להימצא כמעט בכל מקום בגנום, לרבות אזורים מקודדים (אקסונים), אינטרונים ובין גנים. ברב המקרים הידועים, המעצם מופיע על אותו כרומוזום כמו גן המטרה שלו (בכיוון '5 או '3), ואך לעיתים הוא ממוקם על כרומוזום שונה[6][5]. לעיתים קיימות בגנום קבוצות מעצמים המעודדות את ביטוי גן המטרה בזמן או ברקמה ספציפיים הנמצאים בסמיכות זה לזה על רצף ה-DNA; קבוצות המעצמים יכולה לבקר את ביטוי אותו הגן בזמן או ברקמה שונים יכולים להיות מקובצים במיקום גנומי אחר[7]. בנוסף, ניתן למצוא בגנום אזורים המכילים מעצמים רבים וסמוכים המבקרים את ביטויים של גנים שונים. אזור כזה מכונה מעצם-על (למשל הדוגמה של בקרת גני הבטא גלובין)[8][2].

מנגנוני פעילות[עריכת קוד מקור | עריכה]

פעילות המעצמים בגנום חיונית לתפקוד התא, והיא ספציפית לזמן במהלך ההתפתחות העוברית, או לרקמה. כלומר, אם רצף מסוים מתפקד כמעצם ברקמה ספציפית המודיפיקציות האפיגנטיות האופייניות למעצם יופיעו על גבי ההיסטונים והאזור הגנומי הרלוונטי רק באותה הרקמה. באותו אופן, אם מקטע DNA מתפקד כמעצם בזמן התפתחותי מסוים, אותן המודיפיקציות יופיעו רק באותו שלב התפתחותי. להלן מספר דוגמאות:

  • הגן Sonic Hedgehog‏ (SHH) מתבטא במערכת העצבים המרכזית, בתאי אפיתל ובגפיים. יש קבוצת מעצמים ייחודית המבקרת את ביטוי הגן בכל אחת מן הרקמות[9].
  • כל נוירון חישה במערכת הריח מבטא גן יחיד המקודד לקולטן ריח מתוך כ-1400 גנים לקולטני ריח המצויים בגנום. בחירת הקולטן שיתבטא בכל תא מתבצעת על ידי בקרת פעילות באמצעות מעצמים[10].
  • הגן ZEB2 מתבטא בשלב העוברי בו מתפתחת מערכת העצבים, וביטויו במוח הקדמי, במיתר הגב ועוד מבוקר על ידי מעצמים שונים[11].

קישור גורמי תיעתוק לרצף המעצם[עריכת קוד מקור | עריכה]

מודלים לקישור גורמי תיעתוק למעצמים.

על מנת שמעצם יוכל לבקר את תיעתוק גן המטרה שלו, חלבונים גורמי תיעתוק צריכים להיקשר אליו, ולגרום לקיפול פיזי וקירוב של המקטע בגנום המכיל את המעצם אל הקדם של גן המטרה (ראו מטה). קיימים שלושה מודלים לקישור גורמי תיעתוק למעצם והפעלתו:

  • Enhanceosome: גורמי התיעתוק המגויסים אל המעצם נקשרים אליו בסדר מדויק וקפדני. רק לאחר שכל גורמי התיעתוק נקשרו לאתר ההכרה שלהם ברצף ה-DNA של המעצם תתחיל פעילותו[12][13][14]. המודל דומה למתג הפעל/כבה, ובדרך-כלל חיוני כשדרושה תגובה מהירה להפעלת גנים, למשל בתגובה לזיהום נגיפי.
  • Billboard: קבוצה של גורמי תיעתוק יכולה להיקשר למעצם, וגורמי תיעתוק נוספים יכולים להיקשר אליו בנוסף או באופן בלתי-תלוי[15][16][14]. המודל דומה למתג ששולט בעוצמת הפעילות, והוא מאפשר את פעילות המעצם באופן פחות נוקשה (בהשוואה למודל ה-enhanceosome), גם כאשר לא כל גורמי התיעתוק נמצאים.
  • TF collective: בשונה מהמודלים הקודמים המתארים הפעלת מעצם בודד, מודל זה מתאר מצב שבו קבוצת גורמי תיעתוק מפעילה מעצמים שונים. כמו כן, בנוסף לסדר הקישור של גורמי התיעתוק לרצף (שעשוי להשתנות בין מעצם למעצם), ייתכנו אינטראקציות חלבון-חלבון בין גורמי התיעתוק, שגם הן משתנות בין מעצמים שונים. עם זאת, לא ברור האם כל קבוצת גורמי התיעתוק דרושה להפעלת המעצמים (בדומה ל-enhanecosome) או שקישור חלקי מספיק (בדומה ל-billboard[17][18][19][20][14]) .

אינטראקציות בין המעצם לקדם[עריכת קוד מקור | עריכה]

מודלים לאינטראקציות בין המעצם לקדם

כיוון שהמעצם אינו נמצא בסמוך לקדם של גן המטרה שלו, יש צורך בתקשורת ישירה ביניהם בכדי להוליך לבקרת תיעתוק הגן. כאמור למעלה, ברוב המקרים דרוש קיפול פיזי של הכרומטין, כך שהמעצם יגיע לסביבת הקדם של גן המטרה. קיימים ארבעה מודלים לאינטראקציות בין המעצם לקדם (איור 4):

  • Tracking: האנזים RNA פולימראז נקשר למעצם ונע לאורך הכרומטין עד שהוא מגיע לקדם, תוך משיכת המעצם עמו וכיפוף הכרומטין[21][22].
  • Linking: גורמי תיעתוק נקשרים למעצם, וממשיכים להיקשר לאורך הכרומטין עד הגעה לקדם. רק בעת ההגעה לקדם נקשר רנ"א פולימראז[23][24][22].
  • Short-range looping: אינטראקציות חלבון-חלבון בין גורמי תיעתוק הקשורים למעצם לבין גורמי תיעתוק הקשורים לקדם הן אלה הגורמות לקיפול הכרומטין וקירוב בין המעצם לקדם[25][22].
  • Looping-tracking/linking: הכרומטין מתקפל כך שהמעצם נמצא בסביבת הקדם של גן המטרה, אך לא נוגע בו באופן פיזי. שימוש במודל ה-tracking או מודל ה-linking יכול לגשר על המרחק[26][27][22].

עם זאת, קיימות עדויות לכך שהמעצם לא חייב לבוא במגע פיזי עם הקדם, אלא מרחק של 100–300 ננומטרים ביניהם מספיקים בכדי לבקר תיעתוק[28]. המרחק בין אתרי הבקרה בגנום מאפשר את היווצרותם של אזורים בגנום בהם ישנן רמות תיעתוק גבוהות המכונים "מרכזי תיעתוק", והם עשירים באזורי בקרה וגורמי שעתוק[29][30][31][32][22]. בצורה זו מעצם אחד מסוגל לבקר מספר קדמים, וקדם אחד יכול לעבור בקרה על ידי מספר מעצמים בו זמנית, או תוך פרק זמן קצר.

שימור אבולוציוני[עריכת קוד מקור | עריכה]

שימור הרצף[עריכת קוד מקור | עריכה]

אף על פי שמעצמים מתאפיינים במודיפיקציות אפיגנטיות ייחודיות לזמן ולרקמה ולא ברצף נוקלאוטידים קבוע המבדיל בינם לבין אלמנטים אחרים בגנום, קיימת חשיבות מסוימת לשימור הרצף הספציפי של המעצמים השונים. העיקרון לפיו אזורים בעלי תפקיד בגנום נמצאים תחת לחצי ברירה טבעית (סלקציה מטהרת) עשוי לעיתים להצביע על כך שאזור שמור בגנום באזור לא מקודד מתפקד כמקטע בקרתי, ופעמים רבות כמעצם. למשל, מקטע שמור באזור לא מקודד בגנום שלא אופיין כבעל תפקיד בעבר, נמצא כמעצם של הגן STIL בתאי עצב, המשחק תפקיד בבקרת ההפרדה של הכרומוזומים במהלך חלוקת התא[33]. דוגמה נוספת היא אוסף של מקטעים שמורים ולא מקודדים שנמצאו כמעצמים של הגנים IL4, IL5 ו-IL13 הפועלים במערכת החיסון[34].

שימור הפעילות[עריכת קוד מקור | עריכה]

רצפי הנוקלאוטידים של המעצמים נתונים במקרים רבים לשינויים אבולוציוניים מהירים, מה שמקשה לעקוב אחרי מיקומם הגנומי באורגניזמים שונים. עם זאת, קיימות מספר עדויות לכך שמעצמים שנמצאו באורגניזמים קדומים מבחינה אבולוציונית מסוגלים להביא לביטוי גנים באופן ספציפי לסוג התא והרקמה באורגניזמים חדשים יותר מבחינה אבולוציונית, וזאת על אף שאין זהות מוחלטת בין רצפי המעצמים של האורגניזמים. לדוגמה, בחינת המעצם Islet שזוהה בספוג Amphimedon Queenslandica, גילה שאותו רצף מגנום הספוג ביקר ביטוי גנים ספציפי במוח בדגי זברה ובעכברים[35]. השינויים האבולוציוניים המהירים של המעצמים יחד עם שימור הפעילות באורגניזמים רחוקים אבולוציונית עשויים להעיד על כך, שהמעצמים וגורמי התיעתוק הקושרים אותם עוברים שינויים מתואמים (קו-אבולוציה), כך שרצף של המעצם יכיל את אתר ההכרה של גורם התיעתוק הקושר אותו[36]. באופן מעניין, בדומה למעצמים, גם רצפי הקדמים נתונים לשינויים אבולוציוניים מהירים, אך פעילותם בבקרת תיעתוק נשמרת במהלך האבולוציה[37]. עם זאת ה'שפה' בה כתובים אלמנטי בקרה בכלל, ומעצמים בפרט, עדיין לא פוענחה.

שיטות לזיהוי ואפיון מעצמים[עריכת קוד מקור | עריכה]

Enhancer Assay[עריכת קוד מקור | עריכה]

שיטה המשמשת לבחינת הפעילות בבעלי חיים ובתאים (in vivo) של מקטעים המועמדים לתפקד כמעצמים.

תחילה יש לזהות את הרצפים המועמדים בזמן וברקמה המתאימים לפי המודיפיקציות האפיגנטיות שלהם. על מנת לזהות אזורי כרומטין פתוחים ניתן להשתמש בשיטת ATAC-seq (אזורי הכרומטין הנגישים ניתנים לזיהוי על ידי פעילות של אנזים רקומביננטי המסוגל לחתוך אזורים לא מוגנים על ידי חלבונים - אזורי כרומטין פתוחים). על מנת לזהות את חלבוני היסטון 3 הנושאים קבוצת אצטיל (H3K27ac) ניתן להשתמש בשיטת ChIP-seq המשמשת לאיתור אינטראקציות בין DNA לחלבונים תוך שימוש בנוגדן ספציפי לחלבון והמודיפיקאציות שלו.

את המקטעים המועמדים משבטים לפלסמיד יחד עם קדם מינימלי (כשלעצמו אינו מספיק על מנת לבקר תיעתוק) וגן דווח. את הפלסמידים מזריקים לביצית מופרית של דג זברה[38] או של עכבר[39] ועוקבים אחר ביטוי גן הדווח. דפוס הביטוי של גן הדווח ברקמה ובזמן תהליך ההתפתחות העוברי יכול ללמד על הפעילות של הרצף כמעצם.

אמנם השיטה נוחה לביצוע, אך היא מתעלמת מהמרחק הפיזי בין המעצם לבין הקדם, ולא מספקת מידע אודות גן המטרה של המעצם.

Chromosome conformation capture[עריכת קוד מקור | עריכה]

מספר שיטות למציאת אינטראקציות בין אזורים שונים בגנום המבוססות על קיבוע (פיקסציה) של הכרומטין, חיתוכו למקטעים קטנים, ליגציה של אזורים סמוכים פיזית והסרת הפיקסציה של הכרומטין[40][41]. השיטות משמשות למציאת סוגים שונים של אינטראקציות, ולכן קיים שוני ביניהן בשלבים שלאחר הליגציה. אופי שאלת המחקר ישפיע על בחירת השיטה:

  • chromosome conformation capture‏ (3C): משמשת לאיתור אינטראקציות בין שני לוקוסים (one vs. one). יש לתכנן פריימרים (תֶּחֶלים) מתאימים לשני המקטעים אותם מעוניינים לבחון, ולבצע הגברה ב-PCR[42]. השיטה יכולה לשמש לבחינת אינטראקציה משוערת בין קדם למעצם.
  • chromosome conformation capture-on-chip‏ (4C): משמשת לאיתור אינטראקציות בין לוקוס ספציפי לבין כל שאר הלוקוסים בגנום (one vs. all). לאחר הליגציה יש לבצע ליגציה נוספת בכדי ליצור מקטעים מעגליים. יש לתכנן פריימר מתאים למקטע אותו מעוניינים לבחון, ולבצע הגברה ב-inverse PCR (מאפשר הגברה של המקטע הלא ידוע שנמצא בסמיכות למקטע הידוע). לבסוף, המקטעים עוברים ריצוף[43]. השיטה יכולה לשמש לבחינת אינטראקציות של מספר מעצמים עם קדם יחיד.
  • chromosome conformation capture carbon copy‏ (5C): משמשת לאיתור כל האינטראקציות באזור גנומי מוגדר (many vs. many). לאחר הליגציה מתבצעת ליגציה נוספת של פריימרים אוניברסליים לכל המקטעים. לבסוף, כל המקטעים עוברים ריצוף[44]. השיטה יכולה לשמש לבחינת אינטראקציות בין מספר קדמים למספר מעצמים.

מעצמים ומחלות[עריכת קוד מקור | עריכה]

בניגוד לשינויים ברצפים מקודדים הפוגעים בכל הרקמות בהן מתבטא גן נתון, שינויים ברצפי המעצמים יפגעו בביטוי הגן ברקמה בה פועלת בקרת הגן על ידי המעצם. להלן מספר דוגמאות לשינויים במעצמים אשר הוליכו לפנוטיפ:

  • מוטציה במעצם LMBR1 הפועל בגפיים ומבקר את הגן SHH מובילה לריבוי אצבעות (polydactyly)[45] . לעומת זאת, החסרה של המעצם LMBR1 מוביל לאי היווצרות של האצבעות[46]. בנחשים למשל, קיים חסר של 17 נוקלאוטידים במעצם LMBR1, מה שככל הנראה תורם לכך שהם חסרי גפיים[47].
  • SNPs (רב צורניות של נוקלאוטיד בודד) במעצמים המוחיים של הגן BIN1 המתפקד כגן מדכא סרטן נמצאו כקשורים להתפתחות מחלת האלצהיימר[48][2].
  • TBX5 הוא גורם תיעתוק הפועל במהלך התפתחות הלב והגפיים הקדמיות. מוטציות במעצמים הפועלים בלב מובילים לתת-התפתחות של שריר הלב, בעוד שהגפיים לא נפגעות[49].
  • תסמונת Mowat-Wilson מתאפיינת בהתקפים אפילפטיים, עיכוב גדילה ומוגבלות שכלית, והיא נמצאה כקשורה למוטציות בגן ZEB2. נמצא כי חסר במעצמים של ZEB2 הפועלים במערכת העצבים המרכזית עלולים לגרום להופעת תסמונת Mowat-Wilson[11].

ראו גם[עריכת קוד מקור | עריכה]

קישורים חיצוניים[עריכת קוד מקור | עריכה]

  • JASPAR – מאגר מידע למציאת אתרי הכרה וקישור של גורמי שעתוק.
  • EnhancerAtlas – מאגר מידע המכיל מקטעים שזוהו כמעצמים בגנום האנושי.
  • 3D Genome Browser – מאגר מידע למציאת אינטראקציות פיזיות בין אתרים שונים על הכרומטין.

הערות שוליים[עריכת קוד מקור | עריכה]

  1. ^ Driscoll, M. C., Dobkin, C. S., & Alter, B. P., Gamma delta beta-thalassemia due to a de novo mutation deleting the 5'beta-globin gene activation-region hypersensitive sites., Proceedings of the National Academy of Sciences
  2. ^ 1 2 3 Hnisz, D., Abraham, B. J., Lee, T. I., Lau, A., Saint-André, V., Sigova, A. A., Hoke, H. A., & Young, R. A, Super-enhancers in the control of cell identity and disease., Cell
  3. ^ 1 2 3 Andersson, R., Promoter or enhancer, what's the difference? Deconstruction of established distinctions and presentation of a unifying model., Bioessays
  4. ^ Creyghton, M. P., Cheng, A. W., Welstead, G. G., Kooistra, T., Carey, B. W., Steine, E. J., Hanna, J., Lotado, M. A., Frampton, G. M., Sharp, P. A., Boyer, L. A., Young, R. A., & Jaenisch, R. ., Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state., Proceedings of the National Academy of Sciences
  5. ^ 1 2 Ngan, C. Y., Wong, C. H., Tjong, H., Wang, W., Goldfeder, R. L., Choi, C., He, H., Gong, L., Lin, J., Urban, B., Chow, J., Li, M., Lim, J., Philip, V., Murray, S. A., Wang, H., & Wei, C., Chromatin interaction analyses elucidate the roles of PRC2-bound silencers in mouse development., Nature Genetics
  6. ^ Zhang, Y., Wong, C. H., Birnbaum, R. Y., Li, G., Favaro, R., Ngan, C. Y., Lim, J., Tai, E., Poh, H, M., Wong, E., Mulawadi, F, H., Sung, W., Nicolis, S., Ahituv, N., Ruan, Y., & Wei, C., Chromatin connectivity maps reveal dynamic promoter–enhancer long-range associations., Nature
  7. ^ Jeong, Y., El-Jaick, K., Roessler, E., Muenke, M., & Epstein, D. J., A functional screen for sonic hedgehog regulatory elements across a 1 Mb interval identifies long-range ventral forebrain enhancers. ., Development
  8. ^ Whyte, W. A., Orlando, D. A., Hnisz, D., Abraham, B. J., Lin, C. Y., Kagey, M. H., Rahl, P. B., Lee, T. I., & Young, R. A., Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes., Cell
  9. ^ Anderson, E., Devenney, P. S., Hill, R. E., & Lettice, L. A., Mapping the Shh long-range regulatory domain., Development
  10. ^ Bashkirova, E., & Lomvardas, S., Olfactory receptor genes make the case for inter-chromosomal interactions., Current opinion in genetics & development,
  11. ^ 1 2 Bar Yaacov, R., Eshel, R., Farhi, E., Shemuluvich, F., Kaplan, T., & Birnbaum, R. Y., Functional characterization of the ZEB2 regulatory landscape.., Human molecular genetics.
  12. ^ Merika, M., & Thanos, D.., Enhanceosomes., Current opinion in genetics & development
  13. ^ Thanos, D., & Maniatis, T., Virus induction of human IFNβ gene expression requires the assembly of an enhanceosome, Cell
  14. ^ 1 2 3 Spitz, F., & Furlong, E. E., Transcription factors: from enhancer binding to developmental control., Nature reviews genetics
  15. ^ Arnosti, D. N., & Kulkarni, M. M., Transcriptional enhancers: Intelligent enhanceosomes or flexible billboards?, Journal of cellular biochemistry
  16. ^ Kulkarni, M. M., & Arnosti, D. N., Information display by transcriptional enhancers., Development
  17. ^ Junion, G., Spivakov, M., Girardot, C., Braun, M., Gustafson, E. H., Birney, E., & Furlong, E. E.., A transcription factor collective defines cardiac cell fate and reflects lineage history., Cell
  18. ^ Liberman, L. M., & Stathopoulos, A., Design flexibility in cis-regulatory control of gene expression: synthetic and comparative evidence., Developmental biology.
  19. ^ Brown, C. D., Johnson, D. S., & Sidow, A. ., Functional architecture and evolution of transcriptional elements that drive gene coexpression. ., Science
  20. ^ Zinzen, R. P., Girardot, C., Gagneur, J., Braun, M., & Furlong, E. E., Combinatorial binding predicts spatio-temporal cis-regulatory activity., Nature
  21. ^ Kong, S., Bohl, D., Li, C., & Tuan, D., Transcription of the HS2 enhancer toward a cis-linked gene is independent of the orientation, position, and distance of the enhancer relative to the gene., Molecular and cellular biology
  22. ^ 1 2 3 4 5 Furlong, E. E., & Levine, M., Developmental enhancers and chromosome topology, Science
  23. ^ Deng, W., Lee, J., Wang, H., Miller, J., Reik, A., Gregory, P. D., ... & Blobel, G. A., Controlling long-range genomic interactions at a native locus by targeted tethering of a looping factor., Cell
  24. ^ Morcillo, P., Rosen, C., Baylies, M. K., & Dorsett, D., Chip, a widely expressed chromosomal protein required for segmentation and activity of a remote wing margin enhancer in Drosophila., Genes & Development
  25. ^ Dunn, T. M., Hahn, S., Ogden, S., & Schleif, R. F., An operator at-280 base pairs that is required for repression of araBAD operon promoter: addition of DNA helical turns between the operator and promoter cyclically hinders repression., Proceedings of the National Academy of Sciences
  26. ^ Splinter, E., Heath, H., Kooren, J., Palstra, R. J., Klous, P., Grosveld, F., Galjart, N., & de Laat, W., CTCF mediates long-range chromatin looping and local histone modification in the β-globin locus., Genes & development
  27. ^ Wendt, K. S., Yoshida, K., Itoh, T., Bando, M., Koch, B., Schirghuber, E., Tsutsumi, S., Nagae, G., Ishihara, K., Mishiro, T., Yahata, K., Imamoto, F., Aburatani, H., Nakao, M., Imamoto, N., Maeshima, K., Shirahige, K., & Peters, J., Cohesin mediates transcriptional insulation by CCCTC-binding factor., Nature
  28. ^ Heist, T., Fukaya, T., & Levine, M., Large distances separate coregulated genes in living Drosophila embryos, Proceedings of the National Academy of Sciences
  29. ^ Gu, B., Swigut, T., Spencley, A., Bauer, M. R., Chung, M., Meyer, T., & Wysocka, J., Transcription-coupled changes in nuclear mobility of mammalian cis-regulatory elements., Science
  30. ^ Cho, W. K., Spille, J. H., Hecht, M., Lee, C., Li, C., Grube, V., & Cisse, I. I., Mediator and RNA polymerase II clusters associate in transcription-dependent condensates., Science
  31. ^ Sabari, B. R., Dall’Agnese, A., Boija, A., Klein, I. A., Coffey, E. L., Shrinivas, K., Abraham, B. J., Hannett, N. M., Zamudio, A. V., Manteiga, J, C., Li, C. H., Guo, Y. E., Day, D. S., Schuijers, J., Vasile, E., Malik, S., Hnisz, D., Lee, T. I., Cisse, I. I., Roeder, R. G., Sharp, P. A., Chakraborty, A. K., & Young, R. A., Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control., Science
  32. ^ Chong, S., Dugast-Darzacq, C., Liu, Z., Dong, P., Dailey, G. M., Cattoglio, C., Heckert, A., Banala, S., Lavis, L., Darzacq, X., & Tjian, R., Imaging dynamic and selective low-complexity domain interactions that control gene transcription., Science
  33. ^ Göttgens, B., Barton, L. M., Gilbert, J. G., Bench, A. J., Sanchez, M. J., Bahn, S., Mistry, S., Grafham, D., McMurray, A., Vaudin, M., Amaya, E., Bently, D.R., & Green, A.R., Analysis of vertebrate SCL loci identifies conserved enhancers., Nature biotechnology
  34. ^ Loots, G. G., Locksley, R. M., Blankespoor, C. M., Wang, Z. E., Miller, W., Rubin, E. M., & Frazer, K. A., Identification of a coordinate regulator of interleukins 4, 13, and 5 by cross-species sequence comparisons, Science
  35. ^ Wong, E. S., Tan, S. Z., Garside, V., Vanwalleghem, G., Gaiti, F., Scott, E., McGlinn, E., Francois, M & Degnan, B. M., Early origin and deep conservation of enhancers in animals, BioRxiv
  36. ^ Ruvinsky, I., & Ruvkun, G., Functional tests of enhancer conservation between distantly related species, Development
  37. ^ Huang, W., Nevins, J. R., & Ohler, U., Phylogenetic simulation of promoter evolution: estimation and modeling of binding site turnover events and assessment of their impact on alignment tools, Genome biology
  38. ^ Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., Urasaki, A., Kawakami, K., & McCallion, A. S, Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish., Nature protocols
  39. ^ Pennacchio, L. A., Ahituv, N., Moses, A. M., Prabhakar, S., Nobrega, M. A., Shoukry, M., Minovitsky, S., Dubchak, I., Holt, A., Lewis, K. D., Plajzer-Frick, I., Akiyama, J., De Val, S., Afzal, V., Black, B. L., Couronne, O., Eisen, M. B., Visel, A., & Rubin, E. M., In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences, Nature
  40. ^ Hakim, O., & Misteli, T., SnapShot: chromosome conformation capture, Cell
  41. ^ de Wit, E., & De Laat, W., A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization, Genes & development
  42. ^ Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., & Kleckner, N., Capturing chromosome conformation, Science
  43. ^ Simonis, M., Klous, P., Splinter, E., Moshkin, Y., Willemsen, R., De Wit, E., ... & De Laat, W., domains uncovered by chromosome conformation capture–on-chip (4C), Nature genetics
  44. ^ Dostie, J., Richmond, T. A., Arnaout, R. A., Selzer, R. R., Lee, W. L., Honan, T. A., ... & Green, R. D., Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements., Genome research
  45. ^ Lettice, L. A., Heaney, S. J., Purdie, L. A., Li, L., de Beer, P., Oostra, B. A., Goode, D.,Elgar, G., Hill, R. E., & de Graaff, E., A long-range Shh enhancer regulates expression in the developing limb and fin and is associated with preaxial polydactyly., Human molecular genetics
  46. ^ Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., & Shiroishi, T., Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb, Development
  47. ^ Kvon, E. Z., Kamneva, O. K., Melo, U. S., Barozzi, I., Osterwalder, M., Mannion, B. J., Tissieres, V., Pickle, C. S., Plajzer,-Frick, I., Lee, E. A., Kato, M., Garvin, T. H., Akiyama, J. A., Afzal, V., Lopez-Rios, J., Rubin, E. M., Dickle, D. E., Pennachio, L. A., & Visel, A., M., Dickle, D. E., Pennachio, L. A., & Visel, A. (2016). Progressive loss of function in a limb enhancer during snake evolution., Cell
  48. ^ Chapuis, J., Hansmannel, F., Gistelinck, M., Mounier, A., Van Cauwenberghe, C., Kolen, K. V., Geller, F., Sottejeau, Y., Harold, D., Dourlen, P., Grenier-Boley, B., Kamatani, Y., Delepine, B., Demiautte, F., Zelenika, D., Zommer, N., Hamdane, M., Bellenguez, C., Dartigues, J. F., Hauw, J. J., Letronne, F., Ayral, A. M., Sleegers, K., Schellens, A., Broeck, L. V., Engleborghs, S., De Deyn, P. P., Vandnberghe, R., O'Donovan, M., Owen, M., Epelbaum, J., Mercken, M., Karran, E., Bantscheff, M., Drewes, G., Joberty, G., Campion, D., Octave, J. N., Berr, C., Lathrop, M., Callaerts, P., Mann, D., Williams, J., Buee, L., Dewachter, I., Van Broeckhoven, C., Amouyel, P., Moechars, D., Dermaut, B & Lambert, J. C, Increased expression of BIN1 mediates Alzheimer genetic risk by modulating tau pathology., Molecular psychiatry
  49. ^ Smemo, S., Campos, L. C., Moskowitz, I. P., Krieger, J. E., Pereira, A. C., & Nobrega, M. A., Regulatory variation in a TBX5 enhancer leads to isolated congenital heart disease, Human molecular genetics