Real Time PCR

RT-QPCR (ראשי תבות של Real Time Quantitative PCR), היא השיטה הרגישה ביותר לזיהוי ולכימות של ביטוי גנים, במיוחד כאלה שמבוטאים בשכיחות נמוכה או כאשר כמות הרקמה או התאים או דוגמה ביולוגית כלשהי שנמסרת לבדיקה היא קטנה.

יש לשיטה חשיבות רבה בביולוגיה המולקולרית כאשר רוצים קביעה כמותית של מולקולות שמתבטאות רק מעט, דוגמת הורמונים. כמו כן, יש לשיטה חשיבות בדיאגנוזה רפואית בכל הקשור לזיהוי של נגיפים וחיידקים, עמידות לכימותרפיה ועוד.

המכשיר פועל בשני שלבים: בראשון הופך אנזים מסוג רוורס טרנסקריפטאז mRNA ל-cDNA. בשלב השני עובר מקטע ה-cDNA הגברה ב-PCR.

כדי לקבוע את כמותו של מקטע ה-DNA שעובר הגברה (אמפליקון) מכניסים למבחנה שבה נמצאים מרכיבי ריאקצית ה-PCR גם פלואורופור - חומר פלורסנטי דוגמת SYBR-GREEN המסתפח ל-DNA ביחס קבוע למדי לאורך ולמספר המולקולות שנמצאות במבחנות השונות. זיהוי סימון הדנ"א נעשה בעזרת מקור אור, דוגמת לייזר, הלוגן או לדים עם עוצמה גבוהה שגורמים לעירור (excitation) ובעקבותיו לזהירה פלורסנטית של הפלואורופור. הזהירה פלואורסצנטית מזוהה על ידי גלאי, ומועברת למחשב לניתוח. במחשב מותקנת תוכנה שמאפשרת לנו לקבוע מהו מספר מחזורי ה-PCR שנדרש לדוגמה להגיע לרמת פלואורסנציה משמעותית מעבר לרמת הרקע. ערך זה משמש להערכה כמותית של כמות הדוגמה.

בבסיס השיטה עומדת ההנחה שבכל מחזור של ה-PCR מוכפלת כמות המולקולות של תוצרי ה-PCR פי 2 בדיוק, ניתן לאמת זאת על ידי הרצת מבחנות עם מיהולים ידועים של DNA ובחינה של הפרשי המחזורים ביניהם. אם למשל מהלנו דוגמה מסוימת פי 8, יש לצפות לעיכוב של 3 מחזורים בדיוק בדוגמה במהולה (2 בחזקת 3 שווה 8).

הערכה כמותית נעשית בשני אופנים:

• באופן עקיף, ביחס לדוגמה של גן שהתבטאותו חיונית house keeping gene (המכונה גן מנרמל - Normalizer).כאשר ההנחה היא שגן שמתבטא יותר, הזהירה שלו תעלה באופן משמעותי על פני זהירת הרקע במספר קטן יותר של מחזורי PCR. את התוצאה המתקבלת מנרמלים על ידי חלוקת מספר מחזורי ה-PCR שעברה הדוגמה עד לזהירה משמעותית במספר מחזורי ה-PCR שעבר הגן במבחנת הביקורת.

• באופן ישיר, ניתן לכמת בהתבסס על עקום כיול ספציפי לגן. כאשר מכניסים כמות ידועה של DNA למבחנות שונות, ומודדים את מספר המחזורים שלוקח לכל כמות של דוגמה להגיע לזהירה משמעותית.

יש שלוש שיטות נוספות לכימות של דנ"א: תספיג דנ"א, הכלאה באתר ומערכי DNA.