מיצוי נוגדני של כרומטין

מתוך ויקיפדיה, האנציקלופדיה החופשית
קפיצה לניווט קפיצה לחיפוש
מיצוי נוגדני של כרומטין

מיצוי נוגדני של כרומטיןאנגלית: Chromatin Immunoprecipitation‏; בראשי תיבות: ChIP) הוא שיטה המיישמת מיצוי נוגדני הבוחנת אינטראקציות בין חלבונים לחומצות גרעין בתאים. מטרת השיטה היא לזהות חלבונים מסוימים הבאים במגע עם אתרים מסוימים בגנום של התא, כגון פקטורי שעתוק הבאים במגע עם פרומוטורים, או אתרי קישור DNA אחרים, והגדרה של ציסטרומים (cistromes)‏[1] . כמו כן מיצוי נוגדני של כרומטין משמש לזיהוי אתרים ספציפיים בגנום שבהם בוצעו עריכות היסטונים (histone remodeling), ומציינים את אתרי המטרה של חלבונים עורכי היסטונים.[2]

בקצרה, השיטה מתבצעת כדלהלן: חלבונים וכרומטין נמצאים בקישור זמני במיצוי תאים, גדילי הDNA נחתכים ותלכיד החלבון – DNA הקשורים לחלבונים ספציפיים מושקעים על ידי שימוש בנוגדנים ספציפיים להם, גדילי DNA אלו מנוקים ונבדקים ולעיתים מרוצפים. ניתן להסיק שרצפי DNA אלו באים במגע עם החלבון הנבדק בתוך התא (in vivo).

מיצוי נוגדני של כרומטין טיפוסי[עריכת קוד מקור | עריכה]

ישנן שתי שיטות עיקריות של מיצוי נוגדני של כרומטין, והשלב השונה ביניהן הוא הכנת מיצוי התאים וצורת חיתוך גדילי ה-DNA. הראשונה משתמשת בטכניקת הצלבה הפיכה וחיתוך גדילי ה-DNA באמצעות סוניקציה ונקראת מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע צולב (XChIP), בעוד השיטה השנייה אינה מבצעת הצלבה ובה חיתוך ה-DNA מבוצע באמצעות אנזימים המעכלים DNA המופקים מחיידקי המיקרוקוקוס.

מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע צולב (XChIP)[עריכת קוד מקור | עריכה]

מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע צולב היא שיטה למפות אתרי קישור של פקטורי שעתוק, וחלבונים קושרי כרומטין אחרים על גבי ה-DNA. חומרי המוצא שלו הוא מיצוי תאים שעבר קיבוע הצלבה הפיך. קיבוע זה נעשה באמצעות פורמלדהיד[3] או קרינה אולטרה סגולית (UV)[4].

תיאור השיטה[עריכת קוד מקור | עריכה]

מצוי תאים עובר תהליך של קיבוע הצלבה הפיכה באחת השיטות המוזכרות לעיל. לאחר קיבוע ההצלבה גדילי ה-DNA מפורקים בדרך כלל על ידי סוניקציה, תהליך המותיר מקטעים באורך של בין 300-1000 בסיסים חנקניים. מקטעים באורכים של בין 400-500 בסיסים מתאימים ביותר לזיהוי מוטיבים של קישור מאחר שהם באורך קורלטיבי למספר נוקלאוזומים בודד ומאפשרים הסקה של קישור על פי מבנה מרחבי. שאר מיצוי התא מופרד מהתמיסה בהשקעה, ותלכידי חלבון-DNA מושקעים בהשקעה באמצעות נוגדנים ספציפיים לחלבון הנבדק. נוגדנים אלו בדרך כלל מחוברים לחומר המאפשר הפרדה פשוטה, כגון : אגרוז, ספרוז או חלקיקים מגנטיים. התלכידים הנוגדניים המושקעים (כלומר, החלקיק-הנוגדן-חלבון המטרה-ה-DNA) נאספים ונשטפים על מנת להפריד כרומטין שנקשר בצורה לא ספציפית. תלכידים אלו מעוכלים בפרוטאז K, על מנת לשחרר את ה-DNA להמשך אבחון. גרסאות מתויגות של החלבון הנבדק או ביוטינילציה[5] של החלבון יכולים לשמש במקום נוגדנים ספציפיים לחלבון ולאפשר להפרידו ביעילות גבוהה ובעלות נמוכה משעולה לייצר נוגדן חד שבטי. ניתן לזהות את גדיל ה-DNA שהופרד מהתלכיד במספר שיטות, כגון : ריאקציית PCR, שבב, ריצוף מולקולרי, ריצוף מהיר-עיבוד.

מיצוי נוגדני של כרומטין בתנאים טבעיים (NChIP)[עריכת קוד מקור | עריכה]

שיטה זו בעיקר משמשת למיפוי אתרי מטרה של חלבונים עורכי היסטונים. חומר המוצא הוא מיצוי תאים טבעי ללא טיפולים. ה-DNA במצבו הטבעי מלופף סביב ההיסטונים ליצירת הנוקלאוזומים. חותכים את ה-DNA באמצעות אנזימים המעכלים DNA המופקים מחיידקי המיקרוקוקוס, אשר חותכים DNA בין הנוקלאוזומים ומשאירים את הנוקלוזומים שלמים, מקטעי ה-DNA נעים באורכם בין 200 בסיסים (נוקלאוזום בודד), עד לכ-1000 בסיסים (חמישה נוקלאוזומים). שאר הטכניקה זהה לזו המתוארת במיצוי הכרומטין בקיבוע הצולב (XChIP), בנוגע לניקוי, מיצוי, הפקה ואנליזה של DNA מופרד.

השוואה בין שתי שיטות המיצוי[עריכת קוד מקור | עריכה]

היתרון העיקרי בתנאים טבעיים הוא ספציפיות הנוגדנים. הנוגדנים החד שבטיים בהם נעשה שימוש מתוכננים לזהות רצפים חלבוניים סינתטיים קצרים, ולאחר קיבוע צולב בפורמלין תתכן פגיעה במבנה החלבון ואתרי המטרה של נוגדנים אלו. אתרי המטרה פגיעים במיוחד לשינויים בחומצת האמינו ליזין בקצה החנקני. עובדה זו מסבירה את היעילות הנמוכה של מיצוי נוגדנים בקיבוע צולב לעומת בתנאים טבעיים. אך המטרות של שתי השיטות הן שונות כך שהיתרונות של שיטה אחת על האחרת הם יחסיים. קיבוע צולב משמש לזיהוי אתרי פעילות של פקטורי שעתוק וחלבונים קושרי כרומטין אחרים, בעוד מיצוי בתנאים טבעיים בוחן עריכות להיסטונים (ראה טבלה 1).

טבלה 1 היתרונות והחסרונות של מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע צולב ובתנאים טבעיים

מיצוי בקיבוע צולב מיצוי בתנאים טבעיים
יתרונות
  • מתאים לפקטורי שעתוק, וכל חלבון בעל אינטראקציות חלשות עם כרומטין.
  • יישם בכל אורגניזם כאשר חלבונים בתנאים טבעיים קשים למיצוי.
  • יכולת קישור יותר טובה וספציפיות יותר טובה של נוגדני המיצוי.
  • הפקה גדולה יותר של כרומטין, הנובעת מהספציפיות הרבה יותר של הנוגדנים.
חסרונות
  • מיצוי פחות של כרומטין עקב פגיעה באתרי הקישור של הנוגדנים.
  • יכול לתת תשובה שגוייה כאשר יש קיבוע של חלבונים חולפים לכרומטין.
  • מקטעי DNA בגדלים שונים עקב החיתוך האקראי של הDNA.
  • אינו יעיל על חלבונים מלבד היסטונים מאחר שהוא מחייב חלבונים בעלי קישור חזק לDNA‏.
  • לעיתים נוקלאוזומים משתנים במהלך החיתוך.

ההיסטוריה של טכניקות מיצוי נוגדני של כרומטין[עריכת קוד מקור | עריכה]

בשנת 1984 ג'ון ליס (John T. Lis) וחוקר במעבדתו דוד גילמור (David Gilmour), השתמשו בקרינה אולטרה סגולית על מנת לעשות קיבוע צולב של חלבונים ל-DNA בתאי חיידקים חיים. לאחר מיצוי תכולת התאים הם השקיעו באמצעות נוגדנים כנגד RNA פולימראז חיידקי, את ה-DNA שהושקע הם בדקו עם גלאים לאזורים שונים בגנום החיידק כדי לזהות פיזור וצפיפות של RNA פולימראז באזורי הגנים השונים. ב-1985 הם השתמשו באותה השיטה רק הפעם לבדיקת RNA פולימראז 2 באוקריוים בתאי זבוב הפירות, ובדיקה של גלאים של גני עקת חום. עבודות אלו מוגדרות כפריצות הדרך של עבודה עם מיצוי נוגדני של כרומטין.[6][7] מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע צולב שופר ופותח על ידי אלכסנדר ורשבסקי (Alexander Varshavsky) ושותפים, שבדקו את הנוכחות של היסטון H4 על גני עקת חום, במקום להשתמש בקרינה אולטרה סגולית הם השתמשו בפורמלדהיד על מנת לקבע[8][9]. טכניקות אלו שופרו ופותחו מאוד מאז[10]. מיצוי נוגדני של כרומטין בתנאים טבעיים (NChIP) תואר לראשונה על ידי מעבדתו של הביס (Hebbes) ב-1988[11], וגם שיטה זו פותח ושופרה רבות לשימוש נפוץ[12]. שיטת המיצוי המקורית לוקחת כ 4-5 ימים ודורשת כ106- 107 תאים. שיטות חדשות מאפשרות לבצע את התהליך תוך יום אחד ודורשות הרבה פחות תאים כ-100-1000.

מיצוי נוגדני של כרומטין באמצעות נשא - (Carrier ChIP (CChIP[עריכת קוד מקור | עריכה]

שיטה זו יכולה להיות יעילה גם בשימוש של רק כ-100 תאים, על ידי הוספה של תאי זבוב פירות (Drosophila) ככרומטין נשא, ובכך להפחית את אובדן הכרומטין הנבדק בהשקעה, על ידי הטיית שיווי המשקל של ההשקעה. אך כמובן הוא דורש גלאים ספציפיים שיוכלו לזהות את הDNA הנבדק על גבי הרקע של הכרומטין הנשא, שיטה זו לוקחת כיומיים שלושה.[13]

מיצוי מהיר נוגדני של כרומטין - (Fast ChIP (qChIP[עריכת קוד מקור | עריכה]

שיטה זו מאיצה את התהליך על ידי האצה של שני שלבים במהלך המיצוי : 1. אמבט אולטראסוני מאיץ את תהליך הקשירה של הנוגדנים לחלבוני המטרה ובכך מאיץ את תהליך ההשקעה. 2. פרוטוקול מבוסס שרף (Chelex-100) להפרדת DNA מקצר את הפקת הDNA והיפוך הקיבוע הצולב. הניצולת של תהליך זה אינה גבוהה ולכן צריך תמצית תאים המופקת מכמות תאים רבה (כ106~ 107)[14][15]. ניתן לייצר באמצעות שיטה זו עד 24 מקטעי DNA מוכנים לPCR בתוך 5 שעות, שיטה זו מאפשרת בדיקה של פעילות מספר פקטורי שעתוק בו זמנית ולהסתכל על שינויים באוכלוסיות תאים לאורך זמן[16].

מיצוי נוגדני של כרומטין מהיר וכמותי (Quick and quantitative ChIP (Q2ChIP[עריכת קוד מקור | עריכה]

שיטה זו משתמשת בחומר מוצא מיצוי של 105 תאים, ומאפשרת בדיקה של 1000 היסטונים או 100 פקטורי שעתוק. בשיטה זו דוגמאות כרומטין רבות יכולות להיות מוכנות במקביל ולהיבדק במקביל. אורך הבדיקה הוא כיום[17] .

מיקרו מיצוי נוגדני של כרומטין (MicroChIP (µChIP[עריכת קוד מקור | עריכה]

שיטה זו בדרך כלל משתמשת במיצוי מכ-1000 תאים, ומאפשרת לבצע 8 תהליכי מיצוי ללא שימוש בנשא. שיטה זה יכולה להיעשות גם ממיצוי 100 תאים בלבד אך תהליך מיצוי בודד. כמו כן ניתן להשתמש ברקמת ביופסיה של 1 ממ3 . שיטה זו מבוצעת תוך יום אחד[18][19].

מיצוי נוגדני של כרומטין במיקרו-פלטה - Matrix ChIP[עריכת קוד מקור | עריכה]

שיטה זו מאפשרת רמה גבוהה יותר של עיבוד ומפשטת את התהליך, כל תהליך מבוצע במיקרו-פלטה ומאפשר את הפוטנציאל של אוטומציה. בתהליך זה ניתן לעשות 96 מיצויים במקביל, וכל התהליך לוקח יום בודד[20].

מיצוי נוגדני של כרומטין נעשה גם על גנום שלם באמצעות טכנולוגיית "מיצוי נוגדני של כרומטין על שבב" (ChIP-on-chip) או טכנולוגיית ריצוף DNA חדשניות (Chip-Sequencing). כמו כן ניתן לשלב שיטה זו עם טכניקת "ריצוף קצוות מזווגים מתויגים" (paired end tags sequencing) בשיטה הנקראת "בחינת אינטראקציות כרומטין באמצעות ריצוף קצוות מזווגים" Chromatin Interaction Analysis using Paired End Tag sequencing (ChIA-PET), שיטה שנועדה לבחינה של אינטראקציות של כרומטין במבנה מרחבי של יצורים אוקריוטים[21][22][23].

הגבלות של מיצוי נוגדני של כרומטין[עריכת קוד מקור | עריכה]

  • בדיקה רחבת טווח באמצעות מיצוי נוגדני של כרומטין היא מאתגרת. מאחר שצריך ליצור נוגדן ספציפי לכל פקטור שעתוק, או אורגניזם מהונדס המכיל פקטורי שעתוק מתויגים.
  • חקר דוגמאות ביטוי בשיטה זו מהווה בעיה מאחר שישנם שינויים בביטוי בתאים מסוימים בתנאים שונים לחלונות זמן מאוד קטנים.
  • שיטות אלו מתקשות בהבדלה בין איזופומים שונים של פקטורי שעתוק.

ראו גם[עריכת קוד מקור | עריכה]

  • RIP-Chip שיטה דומה המנתחת אינטראקציות בין חלבונים ל-RNA
  • DamID שיטה חלופית שאינה דורשת ייצור של נוגדנים ספציפיים
  • ChIP-exo שיטה המוסיפה נוקלאזות לתהליך ומקטינה את תוצרי ההפקה למקטעים הקושרים.
  • ChIP-on-chip שילוב של שיטת המיצוי עם טכנולוגיית המעבדה על שבב.
  • ChIP-seq

קישורים חיצוניים[עריכת קוד מקור | עריכה]

הערות שוליים[עריכת קוד מקור | עריכה]

  1. ^ Liu, Tao.; Ortiz, Jorge A. (2011). "Cistrome: an integrative platform for transcriptional regulation studies". Genome Biology 12 (8): R83. PMID 21859476. 
  2. ^ Collas, Philippe. (ינואר 2010). "The Current State of Chromatin Immunoprecipitation". Molecular Biotechnology 45 (1): 87–100. PMID 20077036. doi:10.1007/s12033-009-9239-8. 
  3. ^ Jackson, Vaughn (נובמבר 1978). "Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent". Cell 15 (3): 945–54. PMID 569554. doi:10.1016/0092-8674(78)90278-7. בדיקה אחרונה ב-13 במרץ 2010. 
  4. ^ Gilmour DS, Lis JT (אוגוסט 1985). "In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster". Molecular and Cellular Biology 5 (8): 2009–18. PMC 366919. PMID 3018544. בדיקה אחרונה ב-13 במרץ 2010. 
  5. ^ Viens A et al. "Use of protein biotinylation in vivo for chromatin immunoprecipitation" (2004) Analytical Biochemistry 325(1):68-76 [1]
  6. ^ Detecting protein-DNA interactions ... [Proc Natl Acad Sci U S A. 1984] - PubMed - NCBI
  7. ^ In vivo interactions of RNA polymerase II with... [Mol Cell Biol. 1985] - PubMed - NCBI
  8. ^ Varshavsky A (דצמבר 2008). "Discovery of cellular regulation by protein degradation". Journal of Biological Chemistry 283 (50): 34469–89. PMID 18708349. doi:10.1074/jbc.X800009200. בדיקה אחרונה ב-6 במרץ 2010. 
  9. ^ Solomon, Mark J; Larsen Pamela L; Varshavsky, Alexander. (יוני 1988). "Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene". Cell 53 (6): 937–47. PMID 2454748. doi:10.1016/S0092-8674(88)90469-2. בדיקה אחרונה ב-6 במרץ 2010. 
  10. ^ Orlando V (מרץ 2000). "Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation". Trends in Biochemical Sciences 25 (3): 99–104. PMID 10694875. doi:10.1016/S0968-0004(99)01535-2. בדיקה אחרונה ב-14 במרץ 2010. 
  11. ^ Hebbes, Tim R; Thorne, Alan W; Crane-Robinson C. (מאי 1988). "A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin". The EMBO Journal 7 (5): 1395–402. PMC 458389. PMID 3409869. 
  12. ^ O'Neill, Laura P; Turner, Bryan M (ספטמבר 2003). "Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP". Methods (San Diego, Calif.) 31 (1): 76–82. PMID 12893176. doi:10.1016/S1046-2023(03)00090-2. בדיקה אחרונה ב-14 במרץ 2010. 
  13. ^ O'Neill, Laura P; VerMilyea, Matthew D; Turner, Bryan M (יולי 2006). "Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations". Nature Genetics 38 (7): 835–41. PMID 16767102. doi:10.1038/ng1820. 
  14. ^ Nelson, Joel D; Denisenko, Oleg; Sova, Pavel; Bomsztyk, Karol (2006). "Fast chromatin immunoprecipitation assay". Nucleic Acids Research 34 (1): e2. PMC 1325209. PMID 16397291. doi:10.1093/nar/gnj004. 
  15. ^ Nelson, Joel D; Denisenko, Oleg; Bomsztyk, Karol (2006). "Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method". Nature Protocols 1 (1): 179–85. PMID 17406230. doi:10.1038/nprot.2006.27. 
  16. ^ Nelson J, Denisenko O, Bomsztyk K (2009). "The fast chromatin immunoprecipitation method". Methods in Molecular Biology 567: 45–57. PMID 19588084. doi:10.1007/978-1-60327-414-2_3. 
  17. ^ Dahl, John Arne; Collas, Philippe (אפריל 2007). "Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells". Stem Cells 25 (4): 1037–46. PMID 17272500. doi:10.1634/stemcells.2006-0430. 
  18. ^ Dahl, John Arne; Collas, Philippe (2008). "A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP)". Nature Protocols 3 (6): 1032–45. PMID 18536650. doi:10.1038/nprot.2008.68. 
  19. ^ Dahl, John Arne; Collas, Philippe (2009). "MicroChIP: chromatin immunoprecipitation for small cell numbers". Methods in Molecular Biology 567: 59–74. PMID 19588085. doi:10.1007/978-1-60327-414-2_4. 
  20. ^ Flanagin, Steve ; Nelson, Joel D; Castner, David G; Denisenko, Oleg; Bomsztyk, Karol (פברואר 2008). "Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events". Nucleic Acids Research 36 (3): e17. PMC 2241906. PMID 18203739. doi:10.1093/nar/gkn001. 
  21. ^ Fullwood, Melissa J; Han, Yuyuan; Wei, Chia-Lin; Ruan, Xiaoan; Ruan, Yijun (ינואר 2010). "Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing". Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21: Unit 21.15.1–25. PMID 20069536. doi:10.1002/0471142727.mb2115s89. 
  22. ^ Li, Guoliang; Fullwood, Melissa J; Xu, Han; Mulawadi, Fabianus Hendriyan; Velkov, Stoyan; Vega, Vinsensius; Ariyaratne, Pramila Nuwantha; Mohamed, Yusoff Bin; Ooi, Hong-Sain; Tennakoon, Chandana; Wei, Chia-Lin; Ruan, Yijun; Sung, Wing-Kin (פברואר 2010). "ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing". Genome Biology 11 (2): R22. PMC 2872882. PMID 20181287. doi:10.1186/gb-2010-11-2-r22. 
  23. ^ "ChIA-PET: Novel Method For 3-D Whole Genome Mapping Research". ScienceDaily. Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore.. 8 בנובמבר 2009. בדיקה אחרונה ב-14 במרץ 2010.