ריצוף חלבונים בשיטת אדמן
ריצוף חלבונים בשיטת אדמן (באנגלית: Edman degradation) הוא שיטה בביוכימיה לקביעת רצף חומצות האמינו בחלבון. השיטה פותחה על ידי פהר ויקטור אדמן בשנת 1950.
תיאור השיטה
[עריכת קוד מקור | עריכה]שלב ראשון: חיתוך השרשרת הפוליפפטידית לפפטידים קצרים
[עריכת קוד מקור | עריכה]בשיטת אדמן לא ניתן להשתמש עם פפטידים בעלי למעלה מ-50 חומצות אמיניות, מכיוון שכל מחזור מגדיל את כמות הפפטידים שלא עברו את כל הריאקציות בצורה מושלמת, ואיכות הריצוף הולכת וקטנה עם מספר המחזורים. לכן, יש לחתוך את השרשרת הפוליפפטידית לפפטידים קצרים המכילים עד 20 חומצות אמיניות. את הפפטידים הקצרים מפרידים בכרומטוגרפיה על מחליפי יונים או אלקטרופורזה ואז ניתן לרצף אותם בשיטת אדמן. החיתוכים מתבצעים על ידי חומרים שונים (שיטות כימיות או אנזימטיות) ובלבד שיהיו ספציפיים (שוברים קשרים רק אחרי חומצות אמיניות מסוימות). למשל האנזים טריפסין מבצע הידרוליזה רק לקשרים פפטידיים אחרי ליזין או ארגינין.
שלב שני: ריצוף הפפטידים הקצרים
[עריכת קוד מקור | עריכה]- חומצת האמינו הראשונה בפפטיד (הממוקמת בקצה האמיני) מסומנת על ידי קישור קוולנטי של הריאגנט פנילאיזותיוציאנט (Phenylisothiocyanate) המגיב עם קבוצות אלפא אמיניות.
- בחשיפה לתנאים חומציים מתונים, משתחררת נגזרת מעגלית של החומצה האמינית הראשונה (נגזרת של phenylthiohydantoin), בעוד שאר הקשרים הפפטידיים נשארים שלמים.
- הנגזרת המעגלית מופרדת ומזוהה על ידי כרומטוגרפיה או אלקטרופורזה.
מחזור הפעולות מבוצע שוב על הפפטיד ה"מקוצר". בדרך זו, של הסרה עוקבת וזיהוי של החומצה האמינית בקצה האמיני, אפשר לקבוע את הרצף השלם של הפפטיד.
שלב שלישי: מציאת הרצף השלם
[עריכת קוד מקור | עריכה]לאחר שנקבע רצף כל אחד מהפפטידים, נותר לקבוע את סדר הפפטידים הקצרים שיתן את רצף השרשרת הפוליפפטידית המקורית. הדרך היא שילוב המידע שנאסף על רצפי מספר סדרות של פפטידים קצרים שהוכנו מאותה שרשרת בשיטות ביקוע שונות, הנבדלות זו מזו באתרי החיתוך הספציפיים. בעזרת איתור רצפים חופפים מתאפשר פענוח הסידור הרציף בשרשרת הפוליפפטידית המקורית. לדוגמה (בהפשטה), הרצף AAHCCAKK חופף בסופו לרצף CAKKGGEE ולכן ניתן לקבוע כי הרצף השלם הוא AAHCCAKKGGEE.
