ריצוף DNA

מתוך ויקיפדיה, האנציקלופדיה החופשית
קפיצה אל: ניווט, חיפוש
Incomplete-document-purple.svg יש להשלים ערך זה: ערך זה עשוי להיראות מלא ומפורט, אך עדיין חסר בו תוכן מהותי. ייתכן שתמצאו פירוט בדף השיחה.
הנכם מוזמנים להשלים את החלקים החסרים ולהסיר הודעה זו. שקלו ליצור כותרות לפרקים הדורשים השלמה, ולהעביר את התבנית אליהם.
חלק מג'ל עם מקטעי DNA מסומנים
דוגמה לשימוש ב4 צבעים פלואורסנטיים

ריצוף DNA (בעברית הַרְצָפָה[1]) הוא תהליך של קביעת סדר הנוקלאוטידים בקטע דנ"א או רנ"א. בגלל חשיבותו של תהליך הריצוף, פותחו שיטות לריצוף מהיר של מקטעים ארוכים. עדיין, שיטת הריצוף השכיחה ביותר, ואשר באמצעותה נקבעו מרבית הרצפים הגנטיים הידועים כיום מאפשרת קריאה של מקטעים קצרים יחסית, בדרך כלל פחות מ-1000 בסיסים (נוקלאוטידים). ריצוף מקטעים ארוכים יותר נעשה על ידי חיתוך ה-DNA למקטעים קצרים וחופפים, ריצוף של כל אחד מהם בנפרד, והרכבת הרצף הארוך על פי הקטעים החופפים.

מטרה[עריכת קוד מקור | עריכה]

ריצוף דנ"א הוא תהליך שבו קובעים את רצף הנוקליאוטידים שמרכיבים מולקולת דנ"א נתונה. תהליך הריצוף מאפשר את פיתוח תעשיות המחקר הביולוגיות והתרופתיות ומכאן החשיבות לדיוק ולמהירות הריצוף. ריצוף דנ"א יכול לשמש כדי לקבוע את הרצף של גנים בודדים, אזורים גנטיים גדולים יותר, כרומוזומים מלאים או גנומים שלמים. בהתאם לשיטות, תוצאות הריצוף מספקות את סדר הנוקליאוטידים במולקולות הדנ"א שבודדו מתאים של בעלי חיים, צמחים, חיידקים, ארכיאות, וירוסים או כמעט בכל מקור אחר של מידע גנטי. הרצפים הסופיים משמשים חוקרים בתחום הביולוגיה או הגנטיקה להתקדמות מדעית נוספת בתחום הביולוגיה המולקולארית או הגנטית או עשוי להיות בשימוש על ידי אנשי צוות רפואיים לשם קבלת החלטות טיפול או סיוע בייעוץ גנטי.‏[2]

היסטוריה[עריכת קוד מקור | עריכה]

בשנות ה-70 פותח תהליך הריצוף הראשון של מולקולת דנ"א. את הריצוף ביצעו בשיטה המבוססת על כרומטוגרפיה דו ממדית‏[3]. השיטות הראשונות שפיתחו לריצוף דנ"א סיפקו ידע רב אך מנגד היו יקרות. בשנת 1977 פיתח פרדריק סנגר שיטה לריצוף דנ"א שהייתה יקרה ואיטית לעומת הדרישה ההולכת וגדלה לריצוף מהיר וזול‏[4]. במהלך השנים התפתחו שיטות חדשות שמטרתן הייתה להקטין את העלויות ולהוריד את המחיר. שיטות אלו נקראות Next-generation. שיטות חדשות אלו כללו לדוגמה את שיטת pyrosequncing שמבוססת על ניתור ה-pyrophosphate) PPi) שמשתחרר במהלך ראקציית הפילמור של מולקולת הדנ"א‏[5]. כיום מפתחים טכנולוגיות דור 3 במטרה להגדיל את התפוקה, לצמצם את זמן הריצוף ולהוריד את עלויות הריצוף על ידי הקטנת השימוש בחומרים יקרים והגברת היעילות של דנ"א פולימראז[2].

ריצוף בשיטת Sanger[עריכת קוד מקור | עריכה]

שיטת ריצוף ה-DNA הנפוצה ביותר היא שיטת Sanger שפותחה על ידי פרדריק סנגר בשנת 1975[6] ושוכללה ב-1977[7]. על פיתוח השיטה והשימוש בה, זכה סנגר בפרס נובל שני בכימיה בשנת 1980. בשיטה זו משתמשים בפריימרים (תחלים) המתאימים לרצף DNA הצמוד לקטע אותו רוצים לרצף, ובאנזים דנ"א-פולימראז, המשמש להארכת הפריימר (תחל) ליצירת רצף משלים לקטע ה-DNA. בנוסף, יש לספק לתגובה האנזימטית גם dNTPs מארבעת הסוגים (A, T, C ו-G). מבצעים 4 תגובות מקבילות שלכל אחת מהן מספקים גם ddNTP אחד (C, T, A או G) בו יש מימן (במקום הידרוקסיל) גם בעמדה '3 בנוסף לעמדה '2. שילוב של ddNTP ברצף ה-DNA המסונתז במבחנה יביא לעצירת הפולימריזציה. כך, מתקבלים מגוון רצפים שנקטעו באורכים שונים.

הרצת תוצרי התגובות האנזימטיות בג'ל אגרוז בעל יכולת הפרדה של נוקלאוטיד אחד מספקת את הרצף. בכל מבחנה יהיו תוצרים שאורכם הוא המרחק מהתחל ועד הבסיס/הנוקלאוטיד המסוים שהוסף לאותה תגובה בתור ddNTP. כיום נהוג להשתמש במערכות אוטומטיות וב-ddNTPs פלואורסנטיים. מערכות אלה יכולות להשתמש ב-4 חומרים פלואורסנטיים שונים, דבר המאפשר הרצת כל הריאקציות על אותו ג'ל והפרדה בין ה-ddNTPs השונים על פי הפלואורסנציה שלהם.

שיטות ריצוף מהדור החדש[עריכת קוד מקור | עריכה]

בשונה משיטת סנגר, השיטות מהדור החדש (next-generation sequencing) אינן נסמכות על זיהוי הרצף על ידי עצירת הפולימריזציה בכל עמדה ברצף בעזרת נוקלאוטידים מסוג ddNTP. במרבית השיטות החדשות מתבצע זיהוי הרצף על בסיס העיקרון "ריצוף על ידי סינתזה" (sequencing by synthesis), כלומר זיהוי הרצף של מולקולת DNA חד-גדילית מסוימת מבוצע במהלך הפולימרזציה של הגדיל המשלים ונסמכת עליה.

עם שיטות אלו נמנות השיטות הבאות:


השוואת שיטות ריצוף מהדור החדש [8][9]
שיטה Single-molecule real-time sequencing (Pacific Bio)‎ Ion semiconductor (Ion Torrent sequencing) Pyrosequencing ‏(454) ריצוף באמצעות סינתזה (אילומינה) ריצוף באמצעות ליגציה (ריצוף SOLiD) ריצוף סנגר
אורך קריאות 5,500 בסיסים עד 8,500 בסיסים בממוצע (10,000 בסיסים N50); אורך קריאה מרבי >30,000 בסיסים[10][11][12] עד 400 בסיסים 700 בסיסים 50 עד 300 בסיסים 50+35 או 50+50 בסיסים 400 עד 900 בסיסים
דיוק 99.999% דיוק קונצנזוס; 87% דיוק של קריאה בודדת[13] 98% 99.9% 98% 99.9% 99.9%
קריאות בהרצה 50,000 לכל תא SMRT, או ~400 מיליון בסיסים[14][15] עד 80 מיליון 1 מיליון עד 3 מיליארד 1.2 עד .4 מיליארד N/A
זמן הרצה 30 דקות עד שעתיים[16] שעתיים 24 שעות 1 עד 10 ימים, כתלות במרצף ובאורך הקריאות[17] שבוע עד שבועיים 20 דקות עד 3 שעות
למחיר למיליון בסיסים (בדולרים) $0.33-$1.00 $1 $10 $0.05 עד $0.15 $0.13 $2400
יתרונות אורך קריאה ארוך. מהיר. זיהוי מתילציות 4mC, 5mC, 6mA.‏[18] ציוד זול. מהיר. אורך קריאה ארוך. מהיר. פונטנציאל לתפוקה רבה, תלוי בדגם המרצף והיישום המבוקש. מחיר זול לכל בסיס. קריאות בודדות ארוכות. שימושי ליישומים שונים.
חסרונות תופקה בינונית. הציוד עשוי להיות יקר. שגיאות הומופולימרים. ההרצות יקרות. שגיאות הומופולימרים. הציוד עשוי להיות יקר. נדרש ריכוז גבוה של DNA. אטי מיתר השיטות. בעיות בריצוף פולינדרומים.[19] יקר יחסית ולא ישים לפרויקטים גדולים.

Pyrosequencing[עריכת קוד מקור | עריכה]

שיטת ריצוף באמצעות סינתזה, המבוססת על זיהוי שחרור של פירופוספט כשמתחבר נוקלאוטיד לרצף. השיטה הוצגה על ידי מוסטפא רונגי (בפרסית: مصطفی رونقی) ופול נירן (בשבדית: Pål Nyrén) מהמכון הטכנולוגי המלכותי בסטוקהולם ב-1996.

בשיטה נעזרים בDNA פולימראז הבונה את הרצף המשלים לרצף שאותו רוצים לרצף, כשלצדו נמצא אנזים כימולומיניסנטי (הפולט אור). במהלך הריצוף מוסף בכל פעם dNTP שונה, ואם הנוקלאוטיד מתאים לרצף, הוא מתחבר ונפלט פירופוספט. אנזים ATP סולפורילאז יותר מהפירופוספט ATP, המשמש את הלוציפראז ללוציפרין לאוקסולוציפרין הפולט אור. לאחר מכן מנוקים כל ה-dNTPs שלא נקשרו באמצעות ADPase המפרק אותם, וממשיכים בריצוף באמצעות נוקלאוטיד שונה.

אילומינה[עריכת קוד מקור | עריכה]

Postscript-viewer-shaded.png ערך מורחב – ריצוף אילומינה
מרצף אילומינה HiSeq 2500

השיטה פותחה על ידי חוקרים בחברת Manteia Predictive Medicine (אשר נרכשה על ידי חברת סולקסה [Solexa] ב-2004) וסולקסה עצמה, אשר גם היא נרכשה לאחר מכן על ידי חברת אילומינה.

שיטה זו מבוססת על שימוש בצבעים הפיכים אשר מאפשרים את הזיהוי של בסיסים בודדים בעת שהם מצורפים לרצף ה-DNA. ארבעה סוגים של בסיסים מוספים (אדנין, טימין, ציטוזין וגואנין), כאשר כל אחד צבוע פלורסנטי בצבע אחר ומחובר לקבוצה חוסמת החוסמת את הצבע. ארבעת סוגי הבסיסים מתחרים על אזורי הקישור בתבנית ה-DNA לטובת הריצוף ומולקולות שלא נקשרו נשטפות. אחרי כל סינתזה, מסירים באמצעות לייזר את הקבוצה החוסמת בקצה ה-3'. התהליך חוזר על עצמו עד אשר כל מולקולת ה-DNA מרוצפת, בין כל הוספה של נוקלאוטידים יש צורך בשטיפות.

SOLiD[עריכת קוד מקור | עריכה]

SOLiD ‏(Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection; ריצוף באמצעות קשירה וזיהוי של אוליגונוקלאוטידים) היא שיטה שפותחה על ידי Applied Biosystems. הריצוף מבוסס על שני בסיסים המסומנים עם סמן פלואורסנטי.

שיטות בפיתוח[עריכת קוד מקור | עריכה]

Postscript-viewer-shaded.png ערך מורחב – תעלות מרצפות

שיטת תעלות מרצפות, הינה שיטת ריצוף חדשנית המצויה בשלבי פיתוח מתקדמים וטרם זמינה בשוק. השיטה מבוססת על חדירת מולקולת DNA חד-גדילית דרך תעלות חלבוניות, בעלות קוטר של ננומטרים בודדים, הנעוצות בממברנה טבעית או מלאכותית. העברת הממברנה לתמיסה פיזיולוגית, והטענת שני צידיה הממברנה במטען חשמלי מנוגד מאפשרת תנועה של גדיל ה-DNA מצידה האחד של הממברנה לצידה האחר דרך הננו-תעלות. מעבר של בסיסים שונים ברצף החד-גדיל דרך התעלה מביא לשינוי במתח הממברנה, והואיל וכל אחד מארבעת הבסיסי המצויים ב-DNA גורם לשינוי אחר במתח הממברנה ניתן לזהותו על ידי מדידת המתח, כך שמעבר הגדיל השלם מאפשר את זיהוי הרצף כולו. יתרונותיה העיקריים של השיטה הם מהירות הריצוף ועלותו הנמוכה, הואיל והשיטה אינה דורשת שימוש באנזימים, כגון דנ"א פולימרז או בנוקלאוטידים מסומנים פלורוסנטית, אך חסרונה העיקרי הוא אחוז שגיאה גבוה.

ישנן שיטות ריצוף נוספות אשר עושות שימוש בננו-תעלות, ובהן מתבצע זיהוי הבסיסים ברצף באמצעות סימונם בפלורוסנציה שונה, ותוך פולימריזציה של גדיל משלים לחד-גדיל המרוצף על ידי דנ"א פולימרז או עיכולו בסיס-אחר-בסיס בעזרת אקסונוקלאז.

ראו גם[עריכת קוד מקור | עריכה]

קישורים חיצוניים[עריכת קוד מקור | עריכה]

ויקישיתוף מדיה וקבצים בנושא ריצוף DNA בוויקישיתוף

הערות שוליים[עריכת קוד מקור | עריכה]

  1. ^ לפי החלטת האקדמיה ללשון העברית במילון ביולוגיה: מיקרוביולוגיה (תשנ"ה) , 1994
  2. ^ 2.0 2.1 http://www.cell.com/trends/biotechnology/abstract/S0167-7799(06)00263-0
  3. ^ http://jcm.asm.org/content/31/1/22.short‏
  4. ^ F. Sanger, S. A. (1977). DNA seqencing with chain-terminating inhibitors. PNAS , 74 (12), 5463-5467.
  5. ^ http://genome.cshlp.org/content/11/1/3.short
  6. ^ A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase , המאמר שפרסם ב-1975 בכתב העת לביולוגיה מולקולרית
  7. ^ DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, המאמר שפרסמו ב-1977 ב-PNAS
  8. ^ "A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion torrent, pacific biosciences and illumina MiSeq sequencers" (1 January 2012). BMC Genomics 13 (1): 341. doi:10.1186/1471-2164-13-341. PMID 22827831. תבנית:Open access
  9. ^ "Comparison of Next-Generation Sequencing Systems" (1 January 2012). Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012: 1–11. Hindawi Publishing Corporation. doi:10.1155/2012/251364. תבנית:Open access
  10. ^ New Products: PacBio's RS II; Cufflinks | In Sequence | Sequencing | GenomeWeb
  11. ^ After a Year of Testing, Two Early PacBio Customers Expect More Routine Use of RS Sequencer in 2012. GenomeWeb (10 January 2012).תבנית:Registration required
  12. ^ Pacific Biosciences Introduces New Chemistry With Longer Read Lengths
  13. ^ http://www.nature.com/nmeth/journal/v10/n6/full/nmeth.2474.html
  14. ^ De novo bacterial genome assembly: a solved problem? | In between lines of code
  15. ^ "Origins of the Strain Causing an Outbreak of Hemolytic–Uremic Syndrome in Germany" (25 August 2011). N Engl J Med 365 (8): 709–717. doi:10.1056/NEJMoa1106920. תבנית:Open access
  16. ^ "Feasibility of real time next generation sequencing of cancer genes linked to drug response: Results from a clinical trial" (1 January 2012). Int. J. Cancer: 1547–1555. doi:10.1002/ijc.27817. תבנית:Subscription required
  17. ^ van Vliet, Arnoud H.M. (1 January 2010). "Next generation sequencing of microbial transcriptomes: challenges and opportunities". FEMS Microbiology Letters 302 (1): 1–7. doi:10.1111/j.1574-6968.2009.01767.x. תבנית:Open access
  18. ^ Murray, I. A.; Clark, T. A.; Morgan, R. D.; Boitano, M.; Anton, B. P.; Luong, K.; Fomenkov, A.; Turner, S. W.; Korlach, J.; Roberts, R. J. (2 October 2012). "The methylomes of six bacteria". Nucleic Acids Research 40 (22): 11450–62. doi:10.1093/nar/gks891. PMID 23034806. 
  19. ^ Yu-Feng Huang, Sheng-Chung Chen, Yih-Shien Chiang, Tzu-Han Chen & Kuo-Ping Chiu (2012). "Palindromic sequence impedes sequencing-by-ligation mechanism". BMC systems biology 6 Suppl 2: S10. doi:10.1186/1752-0509-6-S2-S10. PMID 23281822.