RT-PCR
RT-PCR (ראשי תיבות של Reverse transcription polymerase chain reaction, בעברית: תגובת שרשרת פולימראזית עם שעתוק לאחור) היא טכניקה מעבדתית המשמשת בביולוגיה מולקולרית להגברת רצפי RNA. הטכניקה מבוססת על שעתוק לאחור של רצפי RNA ל DNA ולאחר מכן PCR – הכפלת מקטע DNA ספציפי מספר רב של פעמים ליצירת אמפליקון.
רקע[עריכת קוד מקור | עריכה]
בכל היצורים המידע הגנטי אצור בחומצות הגרעין הגנומיות. רצף חומצות הגרעין מכילות גנים המקודדים לחלבונים וכן מקטעים ארוכים שאינם מקודדים לחלבונים. בכל היצורים אין כל הגנים מבוטאים (כלומר משועתקים ל- mRNA) באותה העת. כך לדוגמה, בחיידקים מבוטאים גנים לפירוק חומרי תזונה שונים (כמו לקטוז) רק כאשר החומר מצוי בסביבת החיידק. באופן דומה, ביצורים רב תאיים חלבונים שונים מבוטאים בסוגים שונים של תאים, כך לדוגמה אינסולין מיוצר אך ורק בתאי בטא שבלבלב. מאחר ש-mRNA מתורגם לחלבון יש חשיבות רבה בחקר רצפו, רק על ידי בדיקת רצף mRNA ניתן רצף החלבון כיוון שרצף הDNA מכיל אלמנטים שאינם מבוטאים בחלבון כגון אינטרונים בנוסף גנים רבים עוברים שחבור חליפי כך שרצף DNA יחיד יכול ליצור מספר חלבונים.
טכניקת RT-PCR[עריכת קוד מקור | עריכה]
RT-PCR מבוסס על שני שלבים עיקריים:
1- שעתוק לאחור – הפיכת RNA ל-DNA משלים – cDNA בעזרת האנזים רוורס טרנסקריפטאז המופק מנגיף ממשפחת רטרו וירוסים כגון M-MLV האנזים משמש את הווירוס בהפיכת גנום ה-RNA הנגיפי ל-DNA כחלק ממחזור החיים של הנגיף. פרט לאנזים מכילה הריאקציה RNA, נוקלאוטידים (dNTP), בופר, ופריימר: בתגובת RT-PCR מקטע DNA קצר נקשר לקצהו של ה RNA-פריימר, כאשר ידוע מקטע ה-RNA הרצוי הפריימר יהיה ההופכי המשלים שלו, כאשר לא ידוע המקטע או יש עניין במספר מקטעים המקודדים לחלבון ניתן להשתמש בפריימר המכיל רצף בן 15–25 חומצות גרעין של תימין – poly-dT. פריימר זה נקשר ל-mRNA באתר הפוליאדנילציה. כאשר מקטע ה-RNA אינו מקודד לחלבון ולכן אינו מכיל אתר פוליאדנילציה כמו ב-small RNA, או tRNA יש להשתמש בפרימרים אקראיים.
בסיום השלב יש לחמם את תערובת הריאקציה ל-95 מעלות כדי לפרק את הקשר בין ה-DNA ל-RNA.
2- PCR – לאחר יצירת cDNA ניתן להשתמש בו כתבנית -PCR כמו כל DNA. ריאקצית PCR מכילה: אנזים Taq polymerase או אנזים DNA פולימראז תרמופילי אחר, נוקליאוטידים, שני פרימרים, cDNA ובופר מתאים. הריאקציה מורכבת ממספר מחזורים – בדרך כלל 20–40 בני שלושה שלבים כל אחד: דנטורציה (בטמפרטורה 95 מעלות), אנילינג (בטמפרטורה 55–65 מעלות בדרך כלל) ופולימריזציה (טמפרטורה של 72 מעלות).
