מיקרוסקופיה קונפוקלית

צילום במיקרוסקופ קונפוקאלי

מיקרוסקופיה קונפוקלית היא שיטה לדימות אופטי המאפשרת לצפות בחתכים אופקיים דקים ביותר, בעובי קרוב לאורך גל האור הנראה (מאות ננומטרים), של עצמים קטנים, תוך הגברת הניגודיות (קונטרסט) והרזולוציה של התמונה המתקבלת. באמצעות שיטה זו ניתן גם ליצור הדמיה תלת־ממדית של העצם.

השיטה מתבססת על מיקרוסקופ אופטי בעל חריר זעיר (pinhole - לרוב צמצם זעיר שקוטרו הניתן לשינוי) המאפשר רק לאור שמגיע מנקודה מוגדרת בעצם (ממישור מוקד דק), להגיע לגלאי האור. באמצעות סריקה של מישור שלם, מתקבל חתך אופקי דק של הדוגמה הנבחנת תחת המיקרוסקופ. השיטה, שהומצאה על ידי מרוין מינסקי ב-1957, נמצאת בשימוש נרחב במחקר ביולוגי על ידי סימון דגימות בסמנים פלואורניים, וכן בבדיקת רכיבים אלקטרוניים זעירים כגון מוליכים למחצה.

עקרון פיזיקלי

מיבנה המיקרוסקופ הקונפוקאלי

מהלך הקרניים במיקרוסקופ קונפוקלי בסיסי

במיקרוסקופ אור רגיל, כל האור שעובר דרך הדוגמה נאסף דרך עדשה אל הגלאי. אחד החסרונות בשיטה זו הוא שגם אור שהוחזר דרך הדוגמה מעל ומתחת למישור המוקד יגיע לעינית, ובצורה לא ממוקדת. מסיבה זו, התמונה שנוצרת מטושטשת מעט. במיקרוסקופ קונפוקלי לעומת זאת, הדגימה נסרקת פיקסל אחר פיקסל: מקור האור (קרן לייזר אחת או מספר קרני לייזר באורכי גל ידועים) ממוקד באמצעות עדשה כך שיואר רק נפח קטן מאוד מהדוגמה, אשר ממופה לפיקסל בודד בתמונה שתתקבל. בדגימות ביולוגיות אור זה מעורר סמנים פלואורניים בדוגמה הפולטים אור באורך גל שונה מזה הנכנס. האור שמוחזר מהדוגמה נאסף על ידי עדשת האובייקטיב, מועבר דרך מראה דיכרואית (המעבירה את קרן הלייזר המקורית ומחזירה אור באורכי גל אחרים) אל עבר גלאי. חריר קטן שמוצב לפני הגלאי מאפשר רק לאור שהוחזר ממישור צר באובייקט המישור הפוקאלי. הקרן העוברת בחריר נקלטת במכפילור ומתורגמת לאות דיגיטלי המייצג פיקסל בודד.

כדי לקבל חתך אופקי של הדוגמה, מתבצעת סריקה של מישור שלם באמצעות מראות סורקות המבוקרות על ידי מחשב, ומאפשרת לקבל תמונה באיכות ובניגודיות גבוהה. בניגוד למיקרוסקופ רגיל, אי אפשר לראות את הדגימה בעינית, אלא רק על מסך מחשב אשר מרכיב את כל הסריקות לכדי תמונה אחת. לרוב ניתן לשפר את איכות התמונה על ידי מיצוע מספר סריקות עוקבות של התמונה, סגירת הצמצם והעלאת משך החשיפה של כל פיקסל, כל זאת על חשבון משך הסריקה המתארך. כדי ליצור הדמיה תלת־ממדית של העצם, המיקרוסקופ סורק בזה אחר זה מישורים בעומקים שונים. תוכנת מחשב מרכיבה מאוסף המישורים תמונה תלת־ממדית המאפשרת לבחון את העצם בכל חתך נבחר.

סוגי מיקרוסקופים קונפוקליים

גונדה של זבוב פירות מסומנת בשלושה סמנים פלורצנטיים

קיימים ארבעה סוגים עיקריים של מיקרוסקופים קונפוקליים:

• מיקרוסקופ קונפוקלי בסריקת לייזר - שימושי במיוחד בדגימות פלואורניות, כיוון שאור מונוכרומטי מביא לפלואורנות מדויקת יותר ואלומה ממוקדת יותר. במיקרוסקופ אור רגיל, הרזולוציה של התמונה מוגבלת בשל תבנית העקיפה של האור המוחזר מהדגימה. גודלה של תבנית זו תלויה באורך הגל של האור ובמפתח הנומרי (numerical aperture) של העדשה. אולם, במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, מכיוון שהדגימה נסרקת פיקסל אחר פיקסל שמיקומם ידוע, אפשר להגיף את הצמצם המשמש בתור חריר ולמדוד את עוצמת האור שמתקבלת, למשל, רק מתבנית העקיפה מסדר ראשון. במקרה זה, נאמר שהמיקרוסקופ מכוון ליחידת איירי אחת (airy unit). ככל שנקטין את קוטר החריר נקבל תמונה ברזולוציה טובה יותר, אך חלק קטן והולך מעוצמת האור יגיע לגלאי. סריקת הדגימה מביאה לתמונה ברזולוציה וניגודיות גבוהות, אך האיכות מושגת על חשבון איטיות הסריקה והחשיפה הארוכה של הדוגמה לאור. במקרה של דגימות פלואורניות, חשיפה ארוכה מביאה לדיהוי - דעיכה בכמות הפלואורנות מהדגימה. מסיבה זו, קשה לצלם אותה דוגמה מספר רב של פעמים באותה איכות, ובפרט קשה לצלם סרט דינמי הדורש צילום חוזר ונשנה של הדגם.

• מיקרוסקופ קונפוקלי בעל דיסק מסתובב (דיסק ניפקוב) - מתאים לצילום סרטים או דוגמאות הדורשות חשיפה קצרה מאוד. במיקרוסקופ זה, דיסק מחורר (דיסק ניפקוב) מוצב בין מקור האור, למשל הלייזר, לבין לדוגמה. באמצעות סיבוב מהיר של הדיסק, הדוגמה מוארת רק לפרקי זמן קצרים ביותר. עם זאת, איכות כל תמונה בודדת בשיטה זו נמוכה מסריקה באמצעות סריקת לייזר.

• מיקרוסקופ בעל מערך מתכנת - סורק את הדגימה בכמה נקודות בו זמנית בתבנית חצי-אקראית, ומשתמש בגלאים לאור שעובר דרך החריר, כלומר ממוקד כמו במיקרוסקופ קונפוקלי רגיל, וגם לאור ששחזר מחוץ למישור המוקד כמו במיקרוסקופ אור רגיל. מיקום מושכל של הגלאי יחד עם עיבוד של הנתונים הנאספים מהגלאים מאפשרים סריקה מהירה ואיכותית יותר.
• מיקרוסקופ קונפוקלי רב-פוטוני - מאפשר לצלם שכבות עמוקות יותר ברקמות עכורות באמצעות עירור דו-פוטוני, עירור תלת-פוטוני או פיזור הרמוני. מבנים שאינם צנטרו-סימטריים כגון סיבי קולגן, מיאלין, מיוזין ומיקרוטובול גורמים לפיזור דו-הרמוני בעוד ששינויי תווך אופטי כגון מעבר ממים לחלבון גורמים לפיזור תלת-הרמוני כמקרה פרטי של ערבוב ארבעה גלים. דגמים מודרניים של מיקרוסקופים קונפוקליים מאפשרים למדוד את הזמן החולף בין שליחת פעימת הלייזר לקליטת הפוטון הנאסף מהדוגמה, וכך לשערך את זמן החיים הפלואורני של הפלואורופורים המבוטאים בדוגמה. מאחר שפיזור הרמוני הוא תהליך מיידי ואילו פליטה פלואורנית אורכת מאות עד אלפי פיקושניות, ניתן להפריד באופן זה בין הפיזור ההרמוני ממאפיינים מבניים הקיימים ברקמה - קרי סיבים ומעברי תווך - לבין הפליטה הפלואורנית שזמן החיים שלה מושפע בתורו מהתכונות הפיזיולוגיות של הרקמה בסביבה המקומית של המולקולה הפלואורנית.

שימושים

שחלה של זבובת פירות מסומנת בשלושה סמנים פלורוצנטיים

התעשייה והמחקר הביולוגיים עושים שימוש נרחב במיקרוסקופיה קונפוקלית, וכיום קיים מיקרוסקופ קונפוקלי כמעט בכל האוניברסיטאות בארץ. דגימות ביולוגיות כגון תאים או רקמות מתאימות במיוחד למיקרוסקופיה מסוג זה, כיוון שהן לעיתים קרובות שקופות למחצה, וכיוון שניתן לסמן ביו-מולקולות שונות כגון חלבונים ו-DNA, באמצעות חומרים פלואורניים. המיקרוסקופ הקונפוקלי מאפשר לקבל תמונה ברזולוציה גבוהה של אותן מולקולות בתוך או בין התאים. גם במדע החומרים נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית לבחינת תכונות של חומרים שונים, אך במידה פחותה יותר. ציהור רקמות והרחבת רקמות מאפשרים לדמות דוגמאות עבות יותר, הן באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית והן באמצעות מיקרוסקופיית יריעת אור ומיקרוסקופיה רב-פוטונית.

ברפואה, נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית בעיקר בסריקה של הקרנית. הסריקה מאפשרת גילוי מוקדם של מחלות עיניים ובקרה לפני ואחרי ניתוחים.

קישורים חיצוניים

אנגלית

• The VivaScope - the world's first in vivo clinical confocal microscope! (לינק שבור)
• Virtual CLSM (Java-based)
• Another CLSM simulator (Java required)
• Multiphoton fluorescence microscopy
• SVI-wiki on 3D microscopy
• Comprehensive layman's review of CLSM(הקישור אינו פעיל)

עברית

• שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי במחקר, באתר מוזיאון המדע בירושלים