משתמש:Midfit/טיוטה

מיקרוסקופיית עירור רב-פוטונית (Multi-photon excitation microscopy) הינה טכניקה המאפשרת הדמיה של רקמות חיות עבות ברזולוציה גבוהה. אופן פעולתה הייחודי מקטין את הפגיעה ברקמות אותן מאירים, מה שהופך אותה לאחת משיטות ההדמיה הבודדות המאפשרות צפיה ברקמות חיות, כמו מוחות פעילים של ייצורים חיים, מבלי לפגוע בתפקוד מושא המחקר לאורך זמן. על כן, טכניקה זו נמצאת בשימוש יחסית נרחב בביולוגיה ובמדעי המוח, ענפים בהם ישנה חשיבות למזעור הפגיעה או ההפרעה לאיבר שאותו בוחנים תחת המיקרוסקופ.

רקע פיזיקלי[עריכת קוד מקור | עריכה]

עירור "סטנדרטי" כולל מעבר של חלקיק, לדוגמה מולקולה פלואורוסנטית, ממצב היסוד שלה למצב בעל אנרגיה גבוהה יותר ע"י קליטה של חלקיק (נניח פוטון) עם אנרגיה השווה לפער האנרגיה בין שני המצבים. כבר ב- 1931 הוצגה סברה^[1] על ידי Maria Göppert-Mayer כי תהליך זה יכול להתבצע בעזרת שני חלקיקים (פוטונים), כל אחד עם חצי מכמות האנרגיה הדרושה, שמגיעים יחדיו לאותה מולקולה ומעוררים אותה כאילו היו חלקיק אחד. על החלקיקים להגיע באותו הרגע (הפרש שלא עולה על עשירית הפמטו-שניה בערך, 10^-16~ שניות)^[2] לאותה הנקודה בכדי לייצר את האפקט, מה שהקשה מאוד על הדגמה פיזיקלית של רעיון תיאורטי זה במשך עשרות שנים. עם זאת, בתחילת שנות ה- 60, לאחר המצאת הלייזר, מדענים הראו כי ניתן לערוך ניסוי המדגים את העיקרון הפיזיקלי הבסיסי ולעורר מולקולות^[3] ואף אטומים בודדים^[4] בעזרת צמדי פוטונים באורכי גל מתאימים.

אורכי הגל הנפוצים במיקרוסקופיה שכזאת נמצאים לרוב בתחומי האינפרא-אדום, כיוון שהאנרגיה של פוטון הופכית לאורך הגל שלו; במילים אחרות, כשאורך הגל גדל פי שניים האנרגיה נחתכת בחצי. לדוגמה, אם מולקולה פלואורוסנטית נמצאת במצב הייסוד שלה ואנו מעוניינים לעורר אותה לאחד מהמצבים המעוררים שלה, עלינו לכוון לעברה פוטון עם האנרגיה המתאימה לפער אנרגטי זה. אם לפוטון עם אורך גל של 400 ננומטר ישנה אנרגיה מתאימה עבור ניסוי זה, אז גם לשני פוטונים בעלי אורך גל של 800 ננמוטר ישנה אנרגיה מתאימה לעירור המולקולה, וכך גם לשלושה עם אורך גל של 1200 ננומטר, וכו'. אורכי גל ארוכים יותר אלו אכן אופייניים למיקרוסקופיית עירור רב-פוטונית, כאשר אורך הגל המדויק לעירור ייקבע לפי החומרים הפלואורסנטיים בהם נעשה שימוש בניסוי ספציפי.

לעירור המבוסס על שני פוטונים ומעלה ישנה יכולת גבוהה של "חיתוך אופטי" (optical sectioning), כלומר עירור בנקודה או מישור בודדים בדוגמה ולא בכל הנפח המואר. תופעה זאת מתרחשת כתוצאה מהשימוש באורכי הגל הארוכים יותר, כלומר באנרגיות נמוכות יותר לכל פוטון. בעירור המתבצע בעזרת פוטון אחד לכל פוטון ישנה מספיק אנרגיה בכדי לעורר את הדוגמה - אחרת היה נבחר אורך גל אחר, קצר יותר (אנרגיה גבוהה יותר) שמספיק בכדי לעורר את הדוגמה. על כן, עוד לפני שהפוטון מגיע למישור המוקד אותו הוא אמור להאיר סביר שייתקל במולקולה אותה הוא מסוגל לעורר ואכן יעשה זאת. כשהדוגמה היא פלואורסנטית אז המולקולה תפלוט חזרה פוטון באורך גל אחר, וכך יקרה לאורך כל מסלולי הפוטונים בתוך הדוגמה. כתוצאה מכך נפח גדול מאוד מהדוגמה יעורר ויווצר "קונוס אור", תוצאה שאינה רצויה במיקרוסקופיה בה יש רצון לזהות פרטים בודדים מתוך הדוגמה כולה. עם זאת, בעירור המבוסס על שני פוטונים או יותר, לפוטון בודד אין מספיק אנרגיה בכדי לעורר את הדוגמה. בנוסף, הסיכוי שיגיעו שני פוטונים (או יותר) לנקודה קטנה במרחב (כ- 1 פמטוליטר) בו-זמנית הוא נמוך במיוחד וכמעט אפסי מחוץ למישור המוקד. על כן, רק כאשר כלל הפוטונים "מתכנסים" במישור המוקד שאליו כוונו נוצרים תנאים מתאימים לעירור - יש שטף גבוה מספיק שלהם שמעלה את הסיכוי לעירור רב-פוטוני, והוא אכן קורה באותה הנקודה (או המישור), ובה בלבד. תכונה זו נקראת "חיתוך אופטי" כיוון שהעירור מתבצע בחתך אחד בלבד של הדוגמה, ובמידה והדוגמה היא פלואורוסנטית פירושו של דבר הוא שהאור שנפלט מהדוגמה מגיע אך ורק מנקודה אחת בודדת בדוגמה, מה שמקנה לשיטת עירור זו יתרון עצום במיקרוסקופיה של דוגמאות "עבות" יחסית, כלומר בעובי של מעל כמה עשרות בודדות של מיקרון.

מבנה אופטי ואופן הפעולה[עריכת קוד מקור | עריכה]

המבנה האופטי של מיקרוסקופ רב פוטוני הינו בסיסי יחסית, ומורכב ממספר אלמנטים בולטים^[5]. הראשון שבהם הוא מקור אור - הלייזר המעורר את הדוגמה. עד להמצאת הלייזר לא היה ניתן לייצר שטף פוטונים גדול מספיק בכדי לייצר עירור רב-פוטוני, וגם לייזרים מודרניים מסוגלים לייצר את העירור אך ורק במישור המוקד שלהם, כלומר בנקודה בה שטף הפוטונים הוא הגדול ביותר. בכדי להגדיל את הסיכוי לעירור עוד יותר, לרוב משתמשים בלייזרים שפולטים פעימות של אור, כלומר האור "נדחס" לפעימות קצרות ובהירות מאוד, כשבינהן הלייזר לא פולט אור.

האלמנט הנדרש הבא אחראי על ניהוג הקרן (beam steering), כלומר הזזה שלה במרחב. זאת מכיוון שמיקרוסקופ רב-פוטוני לרוב מתבסס על טכניקה של סריקת קרן-לייזר לאורך ולרוחב דוגמה (כאמור, בד"כ פלאורוסנטית), בדומה למיקרוסקופ קונפוקלי. כלומר, בכל רגע נתון קרן האור שנשלחת אל הרקמה מרוכזת כולה בנקודה אחת בדוגמה, והאור החוזר משויך כולו לפיקסל אחד בתמונה הסופית. לאחר סיום איסוף האור מאותו הפיקסל, לרוב תוך כמיקרו שנייה אחת, מראות גלוונומטריות מיוחדות - או כל אלמנט אופטי דומה אחר - מסיטות את קרן האור במעט לכיוון הפיקסל הבא, והתהליך חוזר על עצמו שוב.

האלמנט הבא הוא זוג עדשות המכונות scan lens ו- tube lens (עדשת סריקה ועדשת צינור) המייצרות דמות של המראות הסורקות בגב עדשת האובייקטיב ("עצמית"). דבר זה נדרש לצורך מימוש פעולת הסריקה של המראות על גבי הדוגמה. עדשת האובייקטיב (objective lens) הינה עדשה ש"מתרגמת" את סריקת קרן הלייזר לתנועה שלה על הדוגמה שעליה מסתכלים במיקרוסקופ. בנוסף, במיקרוסקופיה רב פוטונית המתבססת על פלואורוסנציה, האור הנפלט מהדוגמה נאסף דרך עדשת האובייקטיב חזרה ופוגע במסנן. מסנן זה מעוצב כך שהוא יעביר אורכי גל ארוכים (כמו חלון שקוף), אך ישמש כמראה עבור אורכי גל קצרים. תכונה זו מאפשרת לו לנתב את הפוטונים החוזרים מהדוגמה אל גלאי אלקטרוני המסוגל להמיר אור לאות חשמלי, כדוגמת photomultiplier tube, הרכיב האחרון הנדרש במיקרוסקופ רב-פוטוני. לסיום, אותו גלאי מחובר למחשב המציג תמונה המתבססת על קריאת הגלאי בכל נקודה בדוגמה; ככל שנקלטו יותר פוטונים בזמן נתון כך התמונה במחשב, בפיקסל המשויך לנקודה הזו, תהיה בהירה יותר.

תיאור מתמטי[עריכת קוד מקור | עריכה]

עירור רב-פוטוני הוא תהליך לא-ליניארי, כלומר תלוי בחזקה גבוהה של העוצמה או שטף הפוטונים (Intensity, flux) במישור המוקד. ככלל בתהליך רב פוטוני שמבוסס על עירור של $n$ פוטונים, הסיכוי לעירור מוצלח מתכונתי ל- $I^{n}(\mathbf {x} ,t)$ .^[6]^[7] ביטוי זה מדגיש כי עוצמת ההארה תלויה בהתפלגות הפוטונים במרחב - קרן אור גאוסיאנית, לדוגמה - כמו גם בזמן המדויק בו אנו מודדים את השטף. לייזרים המשמשים לעירור רב-פוטוני לרוב עובדים במצב של פולסים, כלומר מאירים רק למשך תקופות קצרות במיוחד, ועל כן לזמן המדידה יש חשיבות גדולה.

הביטוי לעוצמת ההארה של לייזר פולסי יכול גם להיכתב באופן הבא: $I^{n}(\mathbf {x} ,t)\varpropto \left({\frac {P_{\text{avg}}}{F_{\text{rep}}\cdot \tau }}\right)$ . ביטוי זה מראה כי העוצמה, שהיא הספק ליחידת שטח, תלויה באופן ישר בהספק האור, אך גם בכמות הפולסים לשנייה $F_{\text{rep}}$ ובמשכו של כל פולס $\tau$ . ההספק הממוצע של לייזר המשתמש לעירור רב פוטוני הוא כ- 1 וואט, כמות הפולסים לשנייה היא כ- 1-100 מיליון, ומשכו הממוצע של פולס הוא כ- 100 פמטו שניות. ביטוי זה מדגיש את חשיבות השימוש בלייזרים בעלי הספק גבוה ומשך פולס קצר במיוחד בזמן הדמיה של דוגמאות תוך שימוש בשיטת עירור רב-םוטונית.

הערכים הנפוצים שהוזכרו מעלה מובילים אותנו למסקנה כי פולס אור ממוצע של לייזר מכיל כמיליארד פוטונים המגיעים לדוגמה.^[2] בכדי להעריך מה תהיה בהירות הפיקסל אותו אנו מאירים בתמונה הסופית יש להביא בחשבון את היעילות הנמוכה של תהליך העירור ואת העובדה שרק חלק קטן מהפוטונים הנפלטים מהחומר הפלואורסנטי נקלטים בגלאים. לכן, בהערכה גסה, כמות האור המתוארת למעלה תוביל לגילוי של כ- 100 פוטונים מאותה הנקודה.

יתרונות[עריכת קוד מקור | עריכה]

השימוש במיקרוסקופ רב-פוטונים נפוץ במיוחד במדעי החיים והמוח ממספר סיבות. הראשונה היא שהשימוש בפוטונים עם אורכי גל ארוכים מאפשר להם לעבור מרחק רב יותר בתוך הרקמה מבלי להיבלע או להתפזר בתוכה. בעוד שמיקרוסקופ שמתבסס על עירור חד-פוטוני יכול לצלם בעומק של כ- 50 מיקרומטר ברקמה חיה (המסוגלת לבלוע ולפזר אור ביעילות), מיקרוסקופ המתבסס על בליעה דו-פוטונית יכול לחדור לעומק של כמילימטר בתוך הרקמה^[2], או 1000 מיקרומטר. מיקרוסקופ המתבסס על בליעה של שלושה פוטונים כבר מגיע לעומק של כ- 2000 מיקרון ברקמה חיה.^[8] עומקים אלו מאפשרים למדעני מוח, לדוגמה, להקליט מידע מכל שכבות קליפת המוח בחיות מעבדה כמו עכבר, מה שעוזר לפענח את תפקודו הבסיסי של המוח בחולייתנים, כמו גם את השוני בדפוסי פעולתו כתוצאה ממחלות נוירודגנרטיבית כדוגמת אלצהיימר.

יתרון נוסף של מיקרוסקופיה רב-פוטונית הוא הפגיעה המועטת שהיא יוצרת בדוגמה. אורך הגל הארוך מאפשר לפוטונים לעבור דרך רוב הרקמה החיה, עד שהם מגיעים למישור המוקד ושם מייצרים עירור. בנוסף, כשהפוטונים עוברים דרך הרקמה הם לא מבצעים איתה שום אינטרקציה, או במילים אחרות לא משפיעים עליה. ספיגה של הפוטונים ברקמה פירושה חימום שלה - אנרגיית הפוטון עוברת לחימום התאים בנקודה - וחימום גבוה לאורך זמן יכול לגרום לנזק כמו פירוק חלבונים בתאים שעוררו. הגבלת נקודת העירור לאזור קטן מאוד בדוגמה דואגת שגם אם נוצר מעט נזק הוא מקומי בלבד ולא משפיע לאורך, לרוחב ולעומק הרקמה.

יתרון שלישי נובע מיכולות החיתוך האופטיות (optical sectioning) של המיקרוסקופ. כיוון שעירור רב-פוטוני הוא תופעה מאוד מקומית, האור שנפלט מהרקמה (במידה שהיא פלואורסנטית) מגיע אך ורק מנקודה בודדת, ועל כן קל מאוד לשייך את האור שנאסף מנקודה זו לאזור קטן מאוד (פיקסל בודד) בתמונה שאותה יוצר המיקרוסקופ. לו אור היה מגיע ממספר אזורים שונים בדוגמה, היה נדרש בדיעבד להסיק מהו מקור האור המרכזי שגרם לפליטת כל הפוטונים שנקלטו, תהליך עיבוד קשה המכיל חוסר ודאות.

הערות שוליים[עריכת קוד מקור | עריכה]

^ Maria Göppert-Mayer, Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen, Annalen der Physik 401, 1931, עמ' 273–294 doi: 10.1002/andp.19314010303
^ ¹ ² ³ Warren R. Zipfel, Rebecca M. Williams, Watt W. Webb, Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences, Nature Biotechnology 21, 2003-11, עמ' 1369–1377 doi: 10.1038/nbt899
^ W. Kaiser, C. G. B. Garrett, Two-Photon Excitation in Ca${\mathrm{F}}_{2}$: ${\mathrm{Eu}}^{2+}$, Physical Review Letters 7, 1961-09-15, עמ' 229–231 doi: 10.1103/PhysRevLett.7.229
^ I. D. Abella, Optical Double-Photon Absorption in Cesium Vapor, Physical Review Letters 9, 1962-12-01, עמ' 453–455 doi: 10.1103/PhysRevLett.9.453
^ Winifried Denk, James H. Strickler, Watt W. Webb, Two-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy, Science 248, 1990-04-06, עמ' 73–76 doi: 10.1126/science.2321027
^ Chris Xu, Watt W. Webb, Multiphoton Excitation of Molecular Fluorophores and Nonlinear Laser Microscopy, Boston, MA: Springer US, 2002, עמ' 471–540, ISBN 978-0-306-45553-7. (באנגלית)
^ Adam M. Larson, Multiphoton microscopy, Nature Photonics 5, 2011-01, עמ' 1–1 doi: 10.1038/nphoton.an.2010.2
^ Optica Publishing Group, opg.optica.org

[1] Maria Göppert-Mayer, Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen, Annalen der Physik 401, 1931, עמ' 273–294 doi: 10.1002/andp.19314010303

[:0-2] ¹ ² ³ Warren R. Zipfel, Rebecca M. Williams, Watt W. Webb, Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences, Nature Biotechnology 21, 2003-11, עמ' 1369–1377 doi: 10.1038/nbt899

[3] W. Kaiser, C. G. B. Garrett, Two-Photon Excitation in Ca${\mathrm{F}}_{2}$: ${\mathrm{Eu}}^{2+}$, Physical Review Letters 7, 1961-09-15, עמ' 229–231 doi: 10.1103/PhysRevLett.7.229

[4] I. D. Abella, Optical Double-Photon Absorption in Cesium Vapor, Physical Review Letters 9, 1962-12-01, עמ' 453–455 doi: 10.1103/PhysRevLett.9.453

[5] Winifried Denk, James H. Strickler, Watt W. Webb, Two-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy, Science 248, 1990-04-06, עמ' 73–76 doi: 10.1126/science.2321027

[6] Chris Xu, Watt W. Webb, Multiphoton Excitation of Molecular Fluorophores and Nonlinear Laser Microscopy, Boston, MA: Springer US, 2002, עמ' 471–540, ISBN 978-0-306-45553-7. (באנגלית)

[7] Adam M. Larson, Multiphoton microscopy, Nature Photonics 5, 2011-01, עמ' 1–1 doi: 10.1038/nphoton.an.2010.2

[8] Optica Publishing Group, opg.optica.org

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]