תספיג חלבון

Western blot של החלבון CCL5 במספר דוגמאות חלבונים (החלבון מופיע רק בדוגמה 1)

תספיג חלבון (באנגלית: Western blot; נקרא לעיתים גם אימונו-בלוט) היא שיטה לזיהוי חלבון מסוים בתערובת חלבונים על ידי הפרדתם על גבי ג'ל לפי משקל מולקולרי או לפי מטען חשמלי ומבנה מרחבי. גילוי החלבון נעשה על ידי נוגדן ייחודי לחלבון המטרה על גבי קרום ניטרוצלולוזה.

תספיג חלבון (בישראל נפוץ הכינוי "וסטרן בלוט") היא שיטה המשמשת בתחומים שונים של המחקר ביולוגי: ביוכימיה, ביולוגיה מולקולרית וגנטיקה.

השיטה הומצאה במעבדתו של ג'ורג' סטרק מאוניברסיטת סטנפורד וקיבלה את שמה מניל בורנט כמשחק מילים לשיטת "סאת'רן בלוט" (תספיג DNA, שנקרא על שם ממציאו Edwin Southern) ו-"נורת'ן בלוט" (תספיג RNA).

מבוא

תספיג חלבון הוא שיטה לזיהוי חלבון מטרה בדוגמת חלבונים המופקת ממקורות מומסים שונים כגון נוזלים מן החי (סרום, פלזמה, שתן וכדומה) או ממבנים מן החי שעברו הומוגניזציה לשחרור הנוזלים הכלואים בהם (איברים בבעלי חיים, תאים מתרבית רקמה או מנוזלים ביולוגים וחיידקים).

לפי שיטה זו החלבונים מופרדים על גבי ג'ל באלקטרופורזה בהתאם למשקלם המולקולרי (בג'ל מצמית) או בהתאם למטענם החשמלי והמבנה המרחבי שלהם (בג'ל לא מצמית או תם). לאחר מכן מועברים החלבונים לקרום ניטרוצלולוזה או (PVDF (polyvinylidene difluoride על ידי הפעלת כוח חשמלי. גלוי החלבון נעשה על ידי נוגדן ייחודי לחלבון המטרה. הנוגדן מאפשר את גילוי החלבון על ידי תגובה כימית.

הטרחה הכרוכה בשיטה זו מונעת שימש בה בבדיקות רפואיות שגרתיות והיא משמשת בעיקר במחקרים רפואיים. גילוי חלבונים למטרות רפואיות קליניות נעשה בעיקר בשיטת ELISA.

הכנת הדוגמה

דוגמאות חלבונים הנבדקות בתספיג חלבון חייבות להיות מומסות בנוזל מימי. נוזל המכיל חלקיקים בלתי מסיסים ייצור עיוותים בתוצאה. יש מספר שיטות להכנת הדוגמה המסיסה בהתאם למקור הדוגמה:

חלבונים שמקורם בנוזלים ביולוגים

אין צורך למצות חלבונים הנמצאים בנוזלים ביולוגים כך שהם זמינים לשימוש, עם זאת נוזלים ביולוגים מכילים לעיתים קרובות מרכיבים בלתי מסיסים, כך סרום או פלזמה מכילים תאי דם, שתן מכיל חיידקים ומדיום גידול מתרבית רקמה מכיל שברי תאים. כדי להיפטר מחלקיקים אלו ניתן לסרכז את הדוגמה, לרוב סרכוז בעצמה של 12,000g למשך 10 דקות מאפשר את השקעת רוב החלקיקים הבלתי מסיסים. אפשרות נוספת להוצאת חלקיקים בלתי מסיסים היא על ידי סינון עם מסנן בעל פתחים של 0.45 או 0.2 מיקרון. סינון מאפשר גם הוצאת חלקיקים קטנים כמו וירוסים שאינם שוקעים בסרכוז בתנאים רגילים או חלקיקים המכילים אלמנטים שומניים ולכן אינם שוקעים בסרכוז כלל.

לעיתים דוגמאות חלבונים המופקות מנוזלים ביולוגים הן דלילות מדי לגילוי בווסטרן בלוט. על מנת להתגבר על בעיה זאת ניתן לרכז הנוזל בצנטריקון או בהשקעה על ידי מלחים קלי תמס כגון אמוניום סולפט.

חלבונים שמקורם בתאים

כדי לבחון חלבונים מתאים יש למצות את החלבונים מן התאים. בכל השיטות, ראשית, יש להוציא את הנוזל בו גדלו התאים: בתאים הגדלים בתרבית ניתן לשטוף את מדיום הגידול בתמיסה פיזיולוגית, תאי דם, מח עצם או תרבית ברקמה של תאים שאינם נדבקים למצע ניתן לבודד בסרכוז ואז לשטוף בתמיסה פיזיולוגית (לדם חשוב להוסיף נוגדי קרישה כדי למנוע את קרישת התאים). בדם ניתן להפריד את אוכלוסיות התאים השונות מן הסרום ואחת מן השנייה על ידי פיקול, (Ficoll) וכך לבודד את האוכלוסייה הרצויה.

לאחר בידוד וניקוי התאים הרצויים ניתן לפוצץ אותם במספר שיטות:

• בופר המכיל דטרגנט (כגון TWEEN 20).
• מספר מחזורים של הקפאה מהירה (בחנקן נוזלי) והפשרה. בשיטה זאת אין צורך להקיף את התאים בבופר ולכן הריכוז הסופי של הדוגמה גבוה יותר.
• הומוגנייזר (homogenizer) ידני לתאים- מכשיר דמוי מכתש ועלי שבו הרווח בין המכתש לעלי קטן מעביו של תא.
• גלי אולטרה סאונד- יכולים לשבור את ממברנת התאים, בשיטה זאת נוצר חום לכן יש לעשותה בקרח כדי שלא לפגוע בחלבונים, השיטה יעילה מאוד לשבירת ממברנות של חיידקים.

לאחר קריעת ממברנת התא יש לסרכז את הליזט הנוצר על מנת להפריד את הפזה המסיסה מן הפזה הבלתי מסיסה. רק הפזה המסיסה משמשת לווסטרן בלוט.

ניתן להשתמש בצירוף של מספר שיטות שונות על מנת לבודד חלבונים מאברונים שונים בתא, לדוגמה בידוד חלבונים ציטופלזמטיים נעשה על ידי שימוש בדטרגנט בריכוז נמוך ותמיסה איזוטונית. לבידוד חלבונים מגרעין התא יש לבודד תחילה את החלבונים הציטוזמטיים ולאחר מכן לקרוע את ממברנת הגרעין על ידי תמיסה היפוטונית וגלי אולטרה סאונד או הקפאה-הפשרה.

חלבונים שמקורם ברקמה

על מנת לבודד חלבונים מאיבר או מצמחים יש לכתוש את הרקמה בהומוגנייזר חשמלי או בעזרת מכתש ועלי (לרוב בנוכחות בופר וגרגרים קשיחים, כגון חול מעוקר). את הדוגמה יש לסרכז כדי לבודד את הפזה המסיסה.

הפרדת חלבונים באלקטרופורזה

מתקן לאלקטרופורזה של חלבונים

ערך מורחב – אלקטרופורזה

ג'ל בתוך זכוכית לאחר אלקטרופורזה

ניתן להפריד חלבונים על פי גודל, מבנה, נקודה איזואלקטרית ושילוב של הגורמים השונים. אופי ההפרדה תלוי בטיפול בחלבונים לפני הפרדה ובמרכיבי הג'ל.

טיפול בחלבונים לפני ההפרדה

לדוגמת החלבונים מוסיפים בופר המכיל יונים לשמירה על חומציות ומלחיות מתאימה, גליצרול המקל על שקיעת החלבונים על הג'ל, וצבע (לרוב ברומופנול בלו) המאפשר מעקב אחרי קצב התקדמות ההפרדה בג'ל. בג'לים דנטורטיבים - ג'לים בהם נבדק גודל החלבון, יש להוסיף חומר הגורם לדנטורציה של החלבונים על ידי פתיחת המבנה המרחבי שלהם, קיפולם מחדש למבנים גלובולריים אחידים, וטעינת פני השטח שלהם במטען חשמלי שלילי, כל זאת כדי להקל ולאפשר אחידות בתנועה על הג'ל לכוון הקתודה, כך שהפרמטר היחיד שישפיע באופן משמעותי על מהירות תנועתם בג'ל יהיה משקלם המולקולרי (ולא צורתם המרחבית או מטענם החשמלי). לרוב, למטרות אלו נעשה שימוש ב-SDS (סודיום דודציל סולפט). כדי לפרק את הקשרים הדי-סולפידים שבחלבונים מוסיפים לדוגמה גם חומר מחזר. תהליך החיזור נחוץ לשם הפרדת חלבונים פולימרים לשרשראות החלבוניות (תת-היחידות) המרכיבות אותם, וכן לפירוק הקשרים הדי-סולפידיים המייצבים את המבנה השלישוני של החלבון. החומר המחזר הוא לרוב בטא מרקפטו אתנול, Dithiothreitol (DDT), או שילוב של שניהם. יש להרתיח את הדוגמה למספר דקות ולצננה במהירות מייד לאחר מכן, כדי להבטיח את יעילות הדנטורציה והחיזור.

תהליך ההפרדה באלקטרופורזה

הג'לים המקובלים ביותר מבוססים הפולימר פולי-אקריל אמיד. ג'לים אלו מורכבים ממים ומבופר (לרוב בופר Tris ב-pH 8.8, תערובת של אקרילאמיד וביס-אקריל אמיד (ביס אקריל אמיד גורם להסתעפות הפולימר ובכך מחזק את הג'ל). אחוז האקרילאמיד בג'ל קובע את צמיגותו ולכן קובע אלו חלבונים ניתן יהיה להפריד בעזרתו - חלבונים קטנים (בגודל 5 עד 30 אלף דלטון) מומלץ להפריד בג'לים בריכוז 12% אקרילאמיד, בעוד חלבונים גדולים (מעל 200 אלף דלתון) מופרדים טוב ביותר בג'ל בריכוז 7% אקרילאמיד. כדי שהאקרילאמיד ייקרש לפולימר פולי-אקריל אמיד, יש להוסיף אמוניום פר-סולפט (APS) ו-Tetramethylethylenediamine, המכונה לרוב TEMED. שני חומרים אלו גורמים ליצירת רדיקלים חופשיים ובעקבות זאת לתגובת הפולימריזציה.

כדי ליצור ג'ל דנטורטיבי יש להוסיף לג'ל את הדטרגנט SDS, המשחק תפקיד דומה כמו בטיפול בחלבונים לפני ההפרדה: הוא הנקשר לפפטידים למניעת יצירת קשרים בין מולקולארים ביניהם, ומקנה לחלבונים מעטפת של מטען חשמלי שלילי, המאפשרת לו לנוע בהתאם למתח החשמלי המושרה משני צידי הג'ל.

דוגמאות החלבונים מוטענות לתוך בארות שנמצאות בג'ל, הבארות בג'ל דנטורטיבי נמצאות האזור המכיל ג'ל הטענה: ג'ל בצפיפות נמוכה (בסביבות 4% אקריל אמיד) המאפשר לכל החלבונים להגיע לאותה נקודת התחלה. לאחר שהחלבונים יוצאים מג'ל ההטענה עם נכנסים לג'ל ההפרדה (הג'ל התחתון) שם הם מופרדים לפי משקל. לרוב, פרט לדוגמאות החלבונים הנבדקות, באחת הבארות נעשה גם שימוש מרקר (סמן). המרקר מורכב מתערובת של חלבונים צבועים שמשקלם ידוע, על פי המרקר ניתן לקבוע את גודלו של החלבון שהתגלה.

הג'ל מוכנס לתמיסה המעבירה מתח חשמלי (לרוב תמיסה המכילה Tris ו-SDS), כאשר מופעל מתח חשמלי על דוגמת החלבונים, החלבונים נעים לכיוון האלקטרודה החיובית כאשר החלבונים הקטנים נעים בג'ל מהר יותר מן גדולים והכבדים.

ג'ל דו־ממדי (2D Gel)

שיטה מקובלת פחות להפרדת חלבונים היא על ידי ג'ל דו-ממדי. בשיטה זו, דוגמאות החלבונים מוטענות תחילה על ג'ל לא דנטורטיבי, בהפרדה זאת מופרדים החלבונים לפי מטענם החשמלי. לאחר מכן מונחים החלבונים המופרדים על גבי ג'ל דנטורטיבי בזווית של 90 מעלות ומופרדים בהתאם למשקלם המולקולרי.

טרנספר (העברת חלבונים)

לאחר הפרדת החלבונים יש להעבירם למשטח דק על מנת להפוך אותם לזמינים לנוגדנים, לרוב המשטח הוא ממברנת ניטרוצלולוזה. הג'ל מוצמד בחוזקה לממברנת הניטרוצלולוזה בעזרת מתקן הצמדה המכיל ספוגים ונייר ספיגה. המתקן מונח בתא המכיל תמיסה מוליכת זרם, ומיתקן צימוד מונח באופן שהממברנה מוצבת ליד האלקטרודה החיובית. כאשר מופעל מתח חשמלי, החלבונים, הטעונים שלילית כתוצאה מן התגובה עם ה-SDS, נעים לכיוון האלקטרודה החיובית ונספגים בממברנת הניטרוצלולוזה. החלבונים הניספגים בממברנה שומרים על ההפרדה שנוצרה בג'ל, המבנה הכימי של הממברנה מאפשר לה לספוג את חלבונים באופן לא ספציפי.

כדי לבדוק את איכות העברת החלבונים ניתן לצבוע את הממברנה באופן זמני בצבע בפונסו. אינדיקטור נוסף לאיכות העברת החלבונים הוא העברת המרקר- מאחר שהמרקר מכיל חלבונים צבועים בגדלים שונים יש לוודא שהחלבונים הללו יצאו מן בג'ל ונספגו בממברנה.

חסימה

כאמור הממברנה סופגת חלבונים באופן לא ספציפי, כדי להשתמש בנוגדנים (שגם הם כמובן חלבונים) לגילוי החלבון הספציפי יש למנוע קישור של נוגדנים אלו לממברנה באופן לא ספציפי. הדרך למניעת קישור הנוגדנים לממברנה היא על ידי חסימתה בחלבונים שאינם מגיבים עם הנוגדנים. לרוב משתמשים כנוזל חסימה בתמיסת באלבומין בקר (BSA) בריכוז 3% או בחלב דל שומן. מומלץ להוסיף דטרגנט כגון Tween20 לנוזל החסימה. לאחר החסימה ניתן לחשוף את החלבונים לנוגדנים, הנוגדנים יקשרו רק לחלבונים אותם הם מזהים ולא לממברנה באופן ישיר.

גילוי חלבון

בעת תהליך גילוי החלבון, נחשפת הממברנה לנוגדן הנקשר באופן ספציפי לחלבון. לנוגדן זה נקשר נוגדן שניוני המצומד לאנזים, לאחר חשיפה של הנוגדן לסובסטרט נוצרת תגובה כימית פולטת אור או תגובה שמשנה את צבע התוצר הכימי. תגובת הגילוי היא לרוב דו- שלבית אך לעיתים נעשה הגילוי באופן חד שלבי.

גילוי דו שלבי

נוגדן ראשוני

ראשית מודגרת הממברנה עם נוגדן ראשוני, נוגדן נקשר באופן ספציפי לחלבון הנבדק בממברנה. לרוב הנוגדן מומס בתמיסת PBS או TBS המכילה דטרגנט. על מנת למנוע קישור לא ספציפי של נוגדן לממברנה ניתן להוסיף לתמיסה חלבונים שאינם נוגדנים כגון אבקת חלב או אלבומין בקר. ריכוז הנוגדן בתמיסה הוא בין 0.5 ל 50 מיקרו גרם למיליליטר, תלוי בתכונות הנוגדן. הנוגדן מודגר בין 30 דקות לבין מספר ימים בטלטול קל. אם הנוגדן מודגר למשך יותר ממספר שעות מומלץ להוסיף לתמיסה חומר רעיל כגון נתרן אזיד בריכוז 0.05% כדי למנוע גדילה של חיידקים. יש להתאים את טמפרטורת ההדגרה, לרוב בין 4 מעלות ל 37 מעלות צלזיוס, ככל שטמפרטורת ההדגרה עולה, עולה קישור הנוגדן, הן הקישור הספציפי והן הלא ספציפי.

לאחר ההגדרה עם הנוגדן הראשוני יש לשטוף את הנוגדן על ידי טלטול בתמיסת PBS או TBS המכילה דטרגנט למשך מספר דקות עד שעה, יש להחליף את תמיסת השטיפה 2–4 פעמים.

נוגדן שניוני

הנוגדן השניוני הוא נוגדן הנקשר לנוגדנים ממין מסוים של בעלי חיים (לדוגמה נוגדן נגד נוגדנים עכבריים, נוגדן נגד נוגדי ארנבת וכו') הנוגדן השניוני נוצר בחיה ממין אחר ממין החיה שיצרה את הנוגדן הראשוני (כך לדוגמה אם הנוגדן הראשוני נוצר בעכבר הנוגדן השניוני יהיה נוגדן ארנב נגד נוגדני עכבר) לרוב הנוגדן השניוני מיוצר בחיה גדולה ממכרסם (כגון ארנב, חמור או עז) ולרוב הנוגדן השניוני הוא נוגדן רב-שבטי. הנוגדן מצומד באופן כימי לאלמנט מדווח, לרוב אנזים הגורם לריאקצית אור או צבע כגון פרוקסידאז של לפת HRP או אלקלאין פוספטאז AP. לעיתים האלמנט המדווח הוא מולקולה פלואורסצנטית או רדיואקטיבית.

גם הנוגדן השניוני כמו הנוגדן הראשוני מומס ב-PBS או TBS בצירוף דטרגנט וחלבון לחסימה. הנוגדן השניוני מודגר עם הממברנה למשך חצי שעה עד מספר שעות ולאחר מכם נשטף כמו הנוגדן הראשוני. אם הנוגדן השניוני מכיל את האנזים HRP לא ניתן להוסיף אזיד כיוון שהוא מוריד את פעילות האנזים.

גילוי חד שלבי

ווסטרן בלוט

בגילוי חד שלבי הנוגדן הראשוני - הנוגדן הנקשר באופן ספציפי לחלבון הנבדק בממברנה, מכיל אלמנט מדווח כגון האנזים HRP. שיטה זאת פשוטה יותר מן השיטה הדו שלבית אך מחייבת צימוד כימי של הנוגדן לאלמנט המדווח, צימוד שלרוב אינו נעשה במעבדות ביולוגיות אלא במעבדות כימיות או במפעלים ביולוגים. בשיטה החד שלבית משתמשים לרוב במעבדות העוסקות בבדיקות חוזרניות של חלבון ספציפי במספר רב של דוגמאות. בגלל יוקר הנוגדן המצומד וחוסר הגמישות שבשימוש בנוגדן זה, השיטה משמשת בעיקר במעבדות קליניות רוטיניות ולא מעבדות מחקר. חלבונים שנבדקים בשיטה זאת כוללים חלבונים לאבחון נגיף האידס או ונוגדנים בנוזלי גוף שונים (כלומר כאשר הנוגדנים עצמם מוטענים על הג'ל).

גילוי אופטי

ישנן מספר שיטות לגילוי אופטי של החלבון הנחקר, השיטה נבחרת בהתאם לנוגדן השניוני בו נעשה שימוש:

• פוטולומינציה- כאשר הנוגדן השניוני מצומד לאנזים יש להוסיף סובסטרט מתאים (enhanced chemiluminescent או ECL) ליצירת תגובה כימית הגורמת לפלטת פוטונים. הממברנה נחשפת לסרט צילום (הסרט רגיש לאור) למשך מספר שניות עד שעה. במקום בו נמצא החלבון הנחקר נוצרים פוטונים ובעקבות זאת כתם על גבי סרט הצילום.

שיטות נפוצות פחות כוללות:

• שימוש בסובסטרט היוצר תגובת צבע- בסובסטרט יוצר פסי צבע במקום בו כגון TMB/E.
• פלואורסצנציה- הארת הממברנה באור בעל אורך גל קבוע וצילום אור באורך גל שונה. האור החוזר מצולם על ידי מצלמה המצוידת בפילטר חדיר רק לאורך הגל המוחזר.
• גילוי רדיואקטיבי- חשיפת הממברנה אליה מצומד נוגדן שניוני רדיואקטיבי לסרט צילום, שיטה זאת אינה נמצאת בשימוש נרחב בגלל הסכנות שבשימוש בחומרים אלו והחלופות הפשוטות יותר.

קישורים חיצוניים

• פרוטוקול לביצוע ווסטרן בלוט
• סרטון המראה ביצוע של ווסטרן בלוט