אנזים הגבלה

מתוך ויקיפדיה, האנציקלופדיה החופשית
קפיצה אל: ניווט, חיפוש
אופן החיתוך של האנזים EcoRI

אנזימי הגבלה (אנגלית: Restriction enzymes) הם אנזימים המסוגלים לחתוך קטעי DNA באזורים מסוימים מאוד.

אופן פעולה[עריכת קוד מקור | עריכה]

כל אנזים הגבלה מזהה רצף נוקלאוטידים ייחודי ב-DNA, נצמד אליו וחותך את הסליל הכפול במקום ההיצמדות. הרצף או אתר ההגבלה ייחודי לכל אנזים, ומורכב מ-4 עד 12 נוקלאוטידים: לדוגמה, אנזים ההגבלה EcoRI מזהה את הרצף הבא:

  • 3' GAATTC
  • 5' CTTAAG

אנזימים רבים מזהים אתר מטרה פלינדרומי, כלומר אתר שבו רצף הדנ"א זהה בשני הגדילים ולכן ניתן לקריאה משני הצדדים.

האנזים ייצמד אל כל מקום ב-DNA בו קיים רצף זה. החיתוך אותו מבצע האנזים יכול להתרחש במרכז הרצף (כך שברצף לעיל יתקבלו שלושה נוקלאוטידים מצד ימין ושלושה משמאל), אך במרבית המקרים נחתך הגדיל בצורה לא סימטרית, בחיתוך מדורג, דבר המביא ליצירת קצוות דביקים:

  • 3' G|AATTC
  • 5' CTTAA|G

הקו מציין את מקום החיתוך; אופן החיתוך גם הוא ספציפי לכל אנזים הגבלה, ואינו אקראי (כלומר, האנזים EcoRI יחתוך את הרצף תמיד בצורה המוצגת לעיל).

כל אנזימי ההגבלה הם סוגים של אנדונוקלאזות (אנזימים החותכים DNA באמצע הגדיל, זאת בניגוד לאקסונוקלאזות, המפרקים נוקלאוטידים מקצוות הגדיל). אנזימי הגבלה נמצאים באופן טבעי בחיידקים רבים, שם הם משמשים כמנגנון הגנה בפני בקטריופאג'ים (האנזימים חותכים את ה-DNA הפאג'י וגורמים להרס הפאג', בעוד ה-DNA של החיידק ממותל ולא מושפע מאנזים ההגבלה). שמות אנזימי ההגבלה ניתנים להם על שם החיידק בו נמצאו: EcoRI נמצא ב-E. coli; ה-R מייצג זן ספציפי של החיידק (RY13). קיימים שלושה סוגים של אנזימי הגבלה, המסומנים באותיות II ,I ו-III; כל סוג משתמש בשיטה שונה במקצת לחיתוך ה-DNA.

אנזים ההגבלה HindIII, למשל, נמצא בחיידק Haemophilus influenzae והוא אנזים מסוג III.

לאנזימי ההגבלה חשיבות עליונה בביולוגיה מולקולרית, בהנדסה גנטית ובביוטכנולוגיה; גילוים חולל מהפכה של ממש בתחומים אלו.

סוגים[עריכת קוד מקור | עריכה]

את אנזימי ההגבלה מחלקים לשלושה סוגים, המסומנים באותיות II ,I ו-III, על פי מאפיינים כמו הרכב, קופקטורים הדרושים לפעולתם, אופן החיתוך שלהם ומיקום אתר חיתוך ה-DNA שלהם ביחס לרצף המטרה.

  • סוג I ‏(EC 3.1.21.3) - החיתוך מתבצע בריחוק מאתר ההכרה. לפעולתו נדרש ATP ו-S-אדנוזיל-L-מתיונין. פעילותם של אנזימים אלו היא הגבלה ומתילציה (EC 2.1.1.72).
  • סוג II ‏(EC 3.1.21.4) - החיתוך מתבצע בתוך או במרחק קצר מאתר ההכרה; לפעולתם נדרש לרוב מגנזיום; פעילותם של אנזימים אלו מוגבלת כאנזים הגבלה והם לא מבצעים מתילציה.
  • סוג III ‏(EC 3.1.21.5) - החיתוך מתבצע במרחק קצר מאתר ההכרה; לפעילותם נדרש ATP (אך הם לא מפרקים אותו); S-אדנוזיל-L-מתיונין מזרז את התגובה אך אינו נדרש; קיימים כחלק מקומפלקס עם מתיל טראנספראז (EC 2.1.1.72).

סוג I[עריכת קוד מקור | עריכה]

אנזימי הגבלה סוג I היו הראשונים שהתגלו וזוהו לראשונה בשני גזעים שונים (K-12 and B) של E. coli ‏‏[1]. אנזימים אלו חותכים באתר שונה מאתר ההכרה, במרחק של יותר מ-1000 זוגות בסיסים. החיתוך מתרחש בעקבות תהליך של טרנסלוקציה DNA. אתר ההכרה הוא אסימטרי ומורכב משני חלקים: אחד הכולל 3-4 נוקלאוטידים, ואחר הכולל 4-5 נוקלאוטידים - המופרדים על ידי כ-6-8 נוקלאוטידים. לאנזימים אלו פעילות מגוונת, והם מבצעים הן פעילות של חיתוך והן פעילות של מודיפיקציה של הרצף, כתלות במצב המתילציה של DNA המטרה. הקופקטורים S-אדנוזיל-L-מתיונין (AdoMet),‏ ATP ויוני מגנזיום (Mg2+‎) נדרשים לצורך פעילותם המלאה של אנזימים אלו. אנזימי הגבלה מסוג I מורכבים משלוש תת-יחידות‏[2]:

  • HsdR נדרש לצורך הגבלה (חיתוך)
  • HsdM נדרש להוספת קבוצות מתיל ל-DNA (פעילות מתילטרנספראז)
  • HsdS חיוני לספציפיות של אתר ההכרה (DNA-binding) בנוסף לפעילויות ההגבלה והמתילציה

סוג II[עריכת קוד מקור | עריכה]

המבנה של אנזים EcoRI (גדילי תכלת וירוק) הקשור ל-DNA דו גדילי (גדילים חומים).‏[3] שני יוני מנגן בעלי תפקיד קטליטי (אחד בכל מונומר) מוצגים ככדורים סגולים והם סמוכים לאתרי החיתוך בDNA

קיימים מספר הבדלים בין אנזימי הגבלה סוג II לאנזימי הגבלה סוג I. אנזימי סוג II טיפוסיים הם דימרים העשויים מסוג יחיד של תת-יחידה; אתרי ההכרה שלהם הם פלינדרומים ואינם מופרדים, ואורכם 4-8 נוקלאוטידים, החיתוך נעשה באתר ההכרה, והם לא צריכים ATP או AdoMet לפעילותם - לרוב הם צריכים רק Mg2+‎ כקופקטור.‏[4] אנזימים מסוג זה הם אנזימי ההגבלה הזמינים והנפוצים ביותר.

בשנות התשעים של המאה ה-20 ובתחילת שנות ה-2000, אנזימים חדשים מסוג זה התגלו אשר לא ענו לקריטריונים הקלאסיים המגדירים אנזימים אלו, ובעקבות זאת הוגדרו תת-סוגים לחלוקת אנזימים מסוג זה לתת קטגוריות בהתבסס על מאפיינים טיפוסיים. תת-קבוצות אלו מיוצגות על ידי אות סיומת‏[4]:

סוג תיאור דוגמה
IIB הם מולטימרים, המכילים יותר מתת יחידה אחת. הם חותכים את DNA באתר ההכרה משני צידיו. לפעולתם נדרשים הקופקטורים AdoMet ו-Mg2+. BcgI ו-BplI
IIE חותכים DNA בעקבות אינטרקציה עם שני העתקים של רצף ההכרה שלהם.‏[4] אתר הכרה אחד משמש כמטרת החיתוך, ואילו השני משמש כגורם אלוסטרי המאיץ או משפר את יעילות החיתוך. NaeI
IIF דומים לאנזימי IIE, והם פועלים על שני העתקים של רצף ההכרה שלהם, אולם הם חותכים את שני הרצפים במקביל. NgoMIV
IIG הם בעלי תת-יחידה אחת, בדומה לאנזימי סוג II קלאסיים, אולם לפעולתם נדרש הקופקטור AdoMet. Eco57I
IIM מסוגלים לזהות ולחתוך DNA שעבר מתילציה. DpnI
IIS חותכים DNA במרחק מוגדר מאתרי ההכרה הלא פלינדרומים האסימטריים שלהם. אנזימים אלו עשויים לתפקד כדימרים. FokI
IIT מורכבים משתי תת-יחידות שונות. חלק מהם מזהים רצפים פלינדרומים ואילו לאחרים יש אתרי הכרה אסימטריים. Bpu10I ו-BslI

סוג III[עריכת קוד מקור | עריכה]

אנזימי הגבלה סוג III (כדוגמת EcoP15) מזהים שני רצפים לא פלינדרומים נפרדים הפוכים. החיתוך נעשה לאחר כ-20-30 זוגות בסיסים אחרי אתר ההכרה.‏[5] אנזימים אלו מכילים יותר מתת יחידה אחת ודורשים AdoMet ו-ATP לצורך מתילציה וחיתוך, בהתאמה.‏[6] הם חלק ממכניזם ההגבלה-מודיפיקציה של DNA של פרוקריוטיים אשר מגן על האורגניזם מפני פלישת DNA זר. אנזימי סוג III הם חלבונים הטרו-אוליגומטרים המורכבים משתי תת-יחידות:

  • Mod מזהה את רצף הDNA הספציפי למערכת והיא מתילטרנספראז; ככזו היא דומה מבחינה פונקציונלית לתת יחידות M ו-S של אנזימי הגבלה סוג I.
  • Res נדרש לצורך הגבלה, אף על פי שאין לו פעילות אנזימטית בפני עצמו.

אנזימי סוג III מזהים רצף DNA קצר באורך של 5-6 זוגות בסיסים וחותכים במורד (downstream; מכיוון 5' לכיוון 3') 25-27 זוגות בסיסים. על מנת שההגבלה תתבצע נדרשים שני אתרי הכרה הפוכים. אנזימים אלו מוסיפים קבוצת מתיל רק לגדיל אחד של ה-DNA, ודי בכך כדי להגן מפני הגבלה.

אנזימי הגבלה מלאכותיים[עריכת קוד מקור | עריכה]

אנזימי הגבלה מלאכותיים נוצרים על ידי איחוד של מתחם קושר DNA טבעי או מהונדס למתחם נוקלאזי (מתחם נוקלאזי לדוגמה הוא זה של אנזים ההגבלה FokI‏‏[7]). את אנזימי ההגבלה המלאכותיים ניתן להנדס כך שיקשרו לאתרי DNA ארוכים (עד 36 זוגות בסיסים) ולהיקשר לרצפי DNA רצויים.‏[8] נוקלאזות אצבעות אבץ הם אנזימי ההגבלה המלאכותיים הנפוצים ביותר ולהם שימושים בתחום ההנדסה הגנטית,‏[9][10][11][12] אך גם שימושים בשיבוט גנטי סטנדרטי.‏[13]דוגמה אחרת לאנזימי הגבלה מלאכותיים היא כאלו המתבססים על מתחם קושר DNA של חלבוני TAL שמקורם מהחיידק Xanthomonas.‏‏[14][15]

שימושים[עריכת קוד מקור | עריכה]

לאנזימי ההגבלה חשיבות עליונה בביולוגיה מולקולרית, בהנדסה גנטית ובביוטכנולוגיה; גילוים חולל מהפכה של ממש בתחומים אלו. החשיבות נעוצה בקצוות הדביקים הנוצרים לאחר חיתוך ה-DNA. בקטע שהוצג לעיל, בו האנזים חותך את הקטע בקצה, קיימים לאחר החיתוך חמישה נוקלאוטידים חופשיים, אשר אינם מזווגים לנוקלאוטידים אחרים; אם ייפגשו נוקלאוטידים אלו עם נוקלאוטידים מקבילים בקטע DNA אחר (כלומר, A ייפגש עם T ו-C ייפגש עם G), הרי ששני הקטעים יתחברו ליצירת סליל DNA חדש.

זוהי השיטה העיקרית בה משתמשים הביולוגים לחיבור גדילי DNA. השיטה מאפשרת השתלה של גנים בתוך הגנום הקיים של יצור מסוים, ומכאן חשיבותה הרבה. ניתן, למשל, להשתיל את הגן המייצר את ההורמון אינסולין, החיוני לחולי סוכרת, בתוך תאו של חיידק; הגן ישתלב בחומר התורשתי של החיידק, והחיידק יתחיל לייצר אינסולין. לאחר שהחיידק יתחלק (באמצעות מיטוזה), שני הצאצאים ישאו אף הם את גן האינסולין וייצרו אף הם את ההורמון. אם הגן הושתל לתוך פלסמיד, הרי שהחיידק מסוגל עתה להעביר את הגן לחיידקים אחרים באמצעות קוניוגציה. לאחר זמן קצר מתקבלת מושבת חיידקים ענקית המייצרת כמויות נכבדות של אינסולין.

באמצעות אנזימי הגבלה ניתן גם לזהות קטעי DNA שהרצף שלהם ידוע. ניתן לחפש ברצף ה-DNA שאותו מעוניינים לבדוק אתרי הגבלה לאנזימים ידועים, ולבצע חיתוך בעזרת אנזימים אלו. בנוסף, חיתוך באנזימי הגבלה מאפשר שרטוט מפות הגבלה של מקטע מסוים ב-DNA, המספקות מידע חיוני ביותר למהנדסי ביוטכנולוגיה בעת הנדסה הגנטית. לאחר החיתוך יתקבלו כמה מקטעים בגדלים שונים, אותם ניתן לנתח באמצעות אלקטרופורזה.

דוגמאות[עריכת קוד מקור | עריכה]

מבנה קריסטלוגרפי של אנזים ההגבלה HindIII שהוא דימר (מופיע בירוק ותכלת) מצומד ל-DNA דו גדילי (חום)

קיימים למעלה מ-3,500 אנזימי הגבלה שנחקרו, ויותר מ-600 מהם נמכרים באופן מסחרי‏[16]

להלן טבלה של כמה אנזימי הגבלה מוכרים:

אנזים אורגניזם מקור רצף הכרה חיתוך
EcoRI Escherichia coli
5'GAATTC
3'CTTAAG
5'---G     AATTC---3'
3'---CTTAA     G---5'
EcoRII Escherichia coli
5'CCWGG
3'GGWCC
5'---     CCWGG---3'
3'---GGWCC     ---5'
BamHI Bacillus amyloliquefaciens
5'GGATCC
3'CCTAGG
5'---G     GATCC---3'
3'---CCTAG     G---5'
HindIII Haemophilus influenzae
5'AAGCTT
3'TTCGAA
5'---A     AGCTT---3'
3'---TTCGA     A---5'
TaqI Thermus aquaticus
5'TCGA
3'AGCT
5'---T   CGA---3'
3'---AGC   T---5'
NotI Nocardia otitidis
5'GCGGCCGC
3'CGCCGGCG
5'---GC   GGCCGC---3'
3'---CGCCGG   CG---5'
HinfI Haemophilus influenzae
5'GANTCA
3'CTNAGT
5'---G   ANTC---3'
3'---CTNA   G---5'
Sau3A Staphylococcus aureus
5'GATC
3'CTAG
5'---     GATC---3'
3'---CTAG     ---5'
PovII* Proteus vulgaris
5'CAGCTG
3'GTCGAC
5'---CAG  CTG---3'
3'---GTC  GAC---5'
SmaI* Serratia marcescens
5'CCCGGG
3'GGGCCC
5'---CCC  GGG---3'
3'---GGG  CCC---5'
HaeIII* Haemophilus aegyptius
5'GGCC
3'CCGG
5'---GG  CC---3'
3'---CC  GG---5'
HgaI[17] Haemophilus gallinarum
5'GACGC
3'CTGCG
5'---NN  NN---3'
3'---NN  NN---5'
AluI* Arthrobacter luteus
5'AGCT
3'TCGA
5'---AG  CT---3'
3'---TC  GA---5'
EcoRV* Escherichia coli
5'GATATC
3'CTATAG
5'---GAT  ATC---3'
3'---CTA  TAG---5'
EcoP15I Escherichia coli
5'CAGCAGN25NN
3'GTCGTCN25NN
5'---CAGCAGN25NN   ---3'
3'---GTCGTCN25   NN---5'
KpnI[18] Klebsiella pneumoniae
5'GGTACC
3'CCATGG
5'---GGTAC  C---3'
3'---C  CATGG---5'
PstI[18] Providencia stuartii
5'CTGCAG
3'GACGTC
5'---CTGCA  G---3'
3'---G  ACGTC---5'
SacI[18] Streptomyces achromogenes
5'GAGCTC
3'CTCGAG
5'---GAGCT  C---3'
3'---C  TCGAG---5'
SalI[18] Streptomyces albus
5'GTCGAC
3'CAGCTG
5'---G  TCGAC---3'
3'---CAGCT  G---5'
ScaI[18] Streptomyces caespitosus
5'AGTACT
3'TCATGA
5'---AGT  ACT---3'
3'---TCA  TGA---5'
SpeI Sphaerotilus natans
5'ACTAGT
3'TGATCA
5'---A  CTAGT---3'
3'---TGATC  A---5'
SphI[18] Streptomyces phaeochromogenes
5'GCATGC
3'CGTACG
5'---GCATG  C---3'
3'---C  GTACG---5'
StuI[19][20] Streptomyces tubercidicus
5'AGGCCT
3'TCCGGA
5'---AGG  CCT---3'
3'---TCC  GGA---5'
XbaI[18] Xanthomonas badrii
5'TCTAGA
3'AGATCT
5'---T  CTAGA---3'
3'---AGATC  T---5'
* = קצוות חלקים (blunt ends). ‏ N ‏= C או G או T או A. ‏W ‏= A או T

הערות שוליים[עריכת קוד מקור | עריכה]

  1. ^ Murray NE (June 2000). "Type I restriction systems: sophisticated molecular machines (a legacy of Bertani and Weigle)". Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64 (2): 412–34. doi:10.1128/MMBR.64.2.412-434.2000. PMID 10839821. PMC:98998. 
  2. ^ Bickle TA, Krüger DH (June 1993). "Biology of DNA restriction". Microbiol. Rev. 57 (2): 434–50. PMID 8336674. PMC:372918. 
  3. ^ Gigorescu A, Morvath M, Wilkosz PA, Chandrasekhar K, Rosenberg JM (2004). “The integration of recognition and cleavage: X-ray structures of pre-transition state complex, post-reactive complex, and the DNA-free endonuclease”, Alfred M. Pingoud: Restriction Endonucleases (Nucleic Acids and Molecular Biology, Volume 14). Berlin: Springer, 137–178. ISBN 3-540-20502-0. 
  4. ^ 4.0 4.1 4.2 Pingoud A, Jeltsch A (September 2001). "Structure and function of type II restriction endonucleases". Nucleic Acids Res. 29 (18): 3705–27. doi:10.1093/nar/29.18.3705. PMID 11557805. 
  5. ^ Dryden DT, Murray NE, Rao DN (September 2001). "Nucleoside triphosphate-dependent restriction enzymes". Nucleic Acids Res. 29 (18): 3728–41. doi:10.1093/nar/29.18.3728. PMID 11557806. PMC:55918. 
  6. ^ Meisel A, Bickle TA, Krüger DH, Schroeder C (January 1992). "Type III restriction enzymes need two inversely oriented recognition sites for DNA cleavage". Nature 355 (6359): 467–9. doi:10.1038/355467a0. PMID 1734285. 
  7. ^ Kim YG, Cha J, Chandrasegaran S (February 1996). "Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (3): 1156–60. doi:10.1073/pnas.93.3.1156. PMID 8577732. 
  8. ^ Urnov FD, Rebar EJ, Holmes MC, Zhang HS, Gregory PD (September 2010). "Genome editing with engineered zinc finger nucleases". Nat. Rev. Genet. 11 (9): 636–46. doi:10.1038/nrg2842. PMID 20717154. 
  9. ^ Townsend JA, Wright DA, Winfrey RJ, Fu F, Maeder ML, Joung JK, Voytas DF (May 2009). "High-frequency modification of plant genes using engineered zinc-finger nucleases". Nature 459 (7245): 442–5. doi:10.1038/nature07845. PMID 19404258. Bibcode2009Natur.459..442T. 
  10. ^ Shukla VK, Doyon Y, Miller JC, DeKelver RC, Moehle EA, Worden SE, Mitchell JC, Arnold NL, Gopalan S, Meng X, Choi VM, Rock JM, Wu YY, Katibah GE, Zhifang G, McCaskill D, Simpson MA, Blakeslee B, Greenwalt SA, Butler HJ, Hinkley SJ, Zhang L, Rebar EJ, Gregory PD, Urnov FD (May 2009). "Precise genome modification in the crop species Zea mays using zinc-finger nucleases". Nature 459 (7245): 437–41. doi:10.1038/nature07992. PMID 19404259. Bibcode2009Natur.459..437S. 
  11. ^ Ekker SC (2008). "Zinc finger-based knockout punches for zebrafish genes". Zebrafish 5 (2): 121–3. doi:10.1089/zeb.2008.9988. PMID 18554175. 
  12. ^ Geurts AM, Cost GJ, Freyvert Y, Zeitler B, Miller JC, Choi VM, Jenkins SS, Wood A, Cui X, Meng X, Vincent A, Lam S, Michalkiewicz M, Schilling R, Foeckler J, Kalloway S, Weiler H, Ménoret S, Anegon I, Davis GD, Zhang L, Rebar EJ, Gregory PD, Urnov FD, Jacob HJ, Buelow R (July 2009). "Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases". Science 325 (5939): 433. doi:10.1126/science.1172447. PMID 19628861. 
  13. ^ Tovkach A, Zeevi V, Tzfira T (October 2010). "Expression, purification and characterization of cloning-grade zinc finger nuclease". J Biotechnol 151 (1): 1–8. doi:10.1016/j.jbiotec.2010.10.071. PMID 21029755. 
  14. ^ Christian M, Cermak T, Doyle EL, Schmidt C, Zhang F, Hummel A, Bogdanove AJ, Voytas DF (October 2010). "Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases". Genetics 186 (2): 757–61. doi:10.1534/genetics.110.120717. PMID 20660643. 
  15. ^ Li T, Huang S, Jiang WZ, Wright D, Spalding MH, Weeks DP, Yang B (August 2010). "TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain". Nucleic Acids Res 39 (1): 359–372. doi:10.1093/nar/gkq704. PMID 20699274. 
  16. ^ Roberts RJ, Vincze T, Posfai J, Macelis D. (2007). "REBASE--enzymes and genes for DNA restriction and modification". Nucleic Acids Res 35 (Database issue): D269–70. doi:10.1093/nar/gkl891. PMID 17202163. 
  17. ^ R.J Roberts, 1988, Nucl Acids Res. 16(suppl):271 From p.213 Molecular Cell Biology 4th Edition by Lodish, Berk, Zipursky, Matsudaira, Baltimore and Darnell.
  18. ^ 18.0 18.1 18.2 18.3 18.4 18.5 18.6 Monty Krieger; Matthew P Scott; Matsudaira, Paul T.; Lodish, Harvey F.; Darnell, James E.; Lawrence Zipursky; Kaiser, Chris; Arnold Berk (2004). Molecular Cell Biology, 5th, New York: W.H. Freeman and Company. ISBN 0-7167-4366-3. 
  19. ^ Stu I from Streptomyces tubercidicus. Sigma-Aldrich. אוחזר ב־2008-06-07.
  20. ^ Shimotsu H, Takahashi H, Saito H (November 1980). "A new site-specific endonuclease StuI from Streptomyces tubercidicus". Gene 11 (3–4): 219–25. doi:10.1016/0378-1119(80)90062-1. PMID 6260571.