פלואורופור

מתוך ויקיפדיה, האנציקלופדיה החופשית
קפיצה לניווט קפיצה לחיפוש
פלואורסצנציה של ארבעה חומרים שונים תחת תאורת UV. הירוק הוא פלואורוסצאין (אנ'), האדום הוא רודמין B (אנ'), הצהוב הוא רודמין 6G (אנ') והכחול הוא כינין. ריכוז החומרים בתמיסות (שרובן מים) המוצגות הוא כ-0.001 אחוז.

פלואורופור (או פלואורוכרום, בדומה לכרומופור, באנגלית: fluorophore) הוא תרכובת כימית פלואורסצנטית שכאשר מעוררים אותה באמצעות אור באורך גל מסוים, פולטת אור באורך גל שונה, ארוך יותר. פלואורופורים מכילים בדרך כלל כמה קבוצות ארומטיות או מולקולות עם כמה קשרי π.[1]

לפלואורופור מספר יישומים:

בדרך כלל, הפלואורופור נקשר קוולנטית למקרומולקולה, ומשמש כסמן ביולוגי עבור מגיבים (נוגדנים, פפטידים, חומצות גרעין). שימושו העיקרי של הפלואורופור, הכתמת רקמות, תאים, או חומרים נעשה במגוון שיטות אנליטיות כגון דימות פלואורסצנטי וספקטרוסקופיה.[2][3][4]

הסבר פיזיקלי[עריכת קוד מקור | עריכה]

Postscript-viewer-shaded.png ערך מורחב – פלואורסצנציה
דיאגרמת יבלונסקי חלקית: בליעה, דעיכה לא קרינתית ופלואורסצנציה (מעבר בין תת-רמת אנרגיה ויברציונית בתוך רמת הסינגלט, S1 לתת רמת אנרגיה ויברציונית בתוך רמת היסוד, S0)
ספקטרום בליעה ופליטה של רודמין 6G (אנ') עם היסט סטוקס של 25nm.

הפלואורופור בולע אנרגיית אור באורך גל מסוים ופולט אור באורך גל ארוך יותר. אורכי הגל הנבלעים, נצילות העברת האנרגיה והזמן לפני הפליטה תלויים הן במבנה הפלואורופור והן בסביבה הכימית שלו, כאשר המולקולה במצב המעורר מקיימת אינטראקציה עם המולקולות הסובבות.

המונחים האופייניים המשמשים להתייחסות לפלואורופור נתון הם אורכי גל לבליעה מקסימלית ופליטה מקסימלית אך יש חשיבות גם לספקטרום כולו. ספקטרום אורך הגל עשוי להיות פס צר מאוד או רחב מאוד, או מעבר לאורך הגל המתאים לתדר הקיטעון.

בדרך כלל, ספקטרום הפליטה חד יותר מספקטרום הבליעה/עירור, בעל טווח אורכי גל גדולים יותר ואנרגיות נמוכות יותר בהתאמה. טווח אנרגיות העירור נע בין אולטרה סגול לבין האור הנראה, ואילו טווח אנרגיות הפליטה נע בין האור הנראה לבין האינפרא אדום.

המאפיינים העיקריים של פלואורופורים הם:

  • אורך גל לבליעה ולפליטה מקסימליות - מתאים ל"פיק" בספקטרומי הבליעה והפליטה.
  • מקדם הנחתה (או בליעה מולרית, ביחידות של 1 חלקי סנטימטר כפול 1 חלקי מול) - היחס בין כמות האור הנבלעת, באורך גל נתון, לבין ריכוז הפלואורופור בתמיסה.
  • נצילות קוונטית: הנצילות של האנרגיה המועברת מהאור הפוגע לקרינה הנפלטת (היחס בין מספר הפוטונים הנפלטים למספר הפוטונים שנבלעו).
  • זמן חיים (בפיקושניות): משך זמן המצאות הפלואורופור במצב מעורר עד חזרה למצב היסוד. זמן זה נמדד כזמן הדעיכה של אוכלוסיית האלקטרונים במצב המעורר לכדי () מהאוכלוסייה המקורית.
  • היסט סטוקס: ההפרש (בננומטר) בין אורכי הגל של הבליעה והפליטה המקסימליות.

מאפיינים נוספים הם ליבון אופטי או התנגדות אופטית, קיטוב פלואורסצנטי, אנאיזוטרופיות (המושפעת מגודל וצורת המולקולה).

פלואורופור יכול לשמש גם כמדכא קרינה פלואורסצנטית (אנ') של צבענים פלואורסצנטיים אחרים או להעביר את הפלואורסצנציה לאורך גל גדול יותר על ידי FRET.

גודל (משקל מולקולרי)[עריכת קוד מקור | עריכה]

רוב הפלואורופורים מורכבים ממולקולות אורגניות קטנות שמכילות 20-100 אטומים (200-1000 דלטון - המשקל המולקולרי עשוי להיות גבוה יותר בהתאם לשינויים בתרכובות, ומולקולות מצומדות). לעומת זאת, הפלואורופורים הטבעיים, החלבונים, הרבה יותר גדולים כגון ה-GFP שמשקלו המולקולרי הוא 27 אלף דלטון.

הגודל יכול לגרום לאפקט סטרי ולהשפיע על הקיטוב הפלואורסצנטי.

סיווג[עריכת קוד מקור | עריכה]

חלבונים פלואורוסצנטיים בתחום האינפרא אדום (SmURFP (אנ')) מבוססי אוביקוויטין ממחישים את התקדמות מחזור התא.

ניתן לסווג את הפלואורופורים ל-2 קבוצות עיקריות:

  1. פלואורופורים פנימיים (Intrinsic Fluorophores) - פלואורסצנציה מתרחשת באופן טבעי.
  2. פלואורופורים חיצוניים (Extrinsic Fluorophores) - צבענים סינתטיים או ביוכימיקליים מהונדסים שמוסיפים לדגימה על מנת לייצר פלואורסצנציה עם מאפיינים ספקטרליים ספציפיים.

פלואורופורים פנימיים[עריכת קוד מקור | עריכה]

חומצות אמינו ארומטיות - כגון: פנילאלנין, טירוזין, טריפטופן

אנזימים - כגון: NAD, כלורופיל

פלואורופורים חיצוניים[עריכת קוד מקור | עריכה]

משמשים באחת מ-2 צורות:

מתחלקים לחמישה סוגים:[5][6]

פלואורופורים נפוצים[עריכת קוד מקור | עריכה]

גרעיני ליקוציטים אנושיים מוכתמים על ידי הפלואורופור DAPI

צבעני תגובה וצימוד[עריכת קוד מקור | עריכה]

פלואורסצנציה של חומרים שונים תחת תאורת UV. הירוק הוא פלואורוסצאין (אנ'), האדום הוא רודמין B (אנ'), הצהוב הוא רודמין 6G (אנ'), הכחול הוא כינין, והסגול הוא תערובת של כינין ורודמין 6G (אנ'). ריכוז החומרים בתמיסות (שרובן מים) המוצגות הוא כ-0.001 אחוז.
צבען אורך גל בליעה מקסימלית

(ננו-מטר)

אורך גל פליטה מקסימלית

(ננו-מטר)

מסה מולרית
קומרין הידרוקסילי 325 386 331
אמינו קומרין 350 445 330
מתוקסי קומרין 360 410 317
NBD 466 539 294
R-PE (פיקוארתרין אדום) 480;565 578 240 אלף
חלבון כלורופיל פירידין 490 675 35KDa
פלואורוסצאין 495 519 389

צבעני חומצות גרעין[עריכת קוד מקור | עריכה]

דגימת DNA מופרדת על ידי ג'ל אלקטרופורזה של חומצות גרעין ומוכתמת עם אתידיום ברומיד שפולט אור בצבע כתום אחרי קישורו עם ה-DNA.
צבען אורך גל בליעה מקסימלית

(ננו-מטר)

אורך גל פליטה מקסימלית

(ננו-מטר)

מסה מולרית
Hoechst 33342 343 483 616
DAPI 345 455
Hoechst 33258 345 478 624
אתידיום ברומיד 493 620 394

חלבונים פלואורוסצנטיים[עריכת קוד מקור | עריכה]

צבען אורך גל בליעה מקסימלית

(ננו-מטר)

אורך גל פליטה מקסימלית

(ננו-מטר)

מסה מולרית QY
GFP - מוטצית Y66H  360 442
GFP - מוטצית Y66F  360 508
BPE (כחול) 545 572 240KDa 0.98
RPE (אדום) 565 >498 573 250KDa 0.84

יישומים[עריכת קוד מקור | עריכה]

לפלואורופורים יש חשיבות מיוחדת בתחומי הביוכימיה ומחקר החלבון, כמו גם באנליזה של התא (אימונוהיסטוכימיה) וחישה ביולוגית זעירה.[3][7]

יישומים מחוץ לתחום מדעי החיים[עריכת קוד מקור | עריכה]

ראו גם[עריכת קוד מקור | עריכה]

קישורים חיצוניים[עריכת קוד מקור | עריכה]

ויקישיתוף מדיה וקבצים בנושא פלואורופור בוויקישיתוף

הערות שוליים[עריכת קוד מקור | עריכה]

  1. ^ Juan Carlos Stockert, Alfonso Blázquez-Castro (2017). "Chapter 3 Dyes and Fluorochromes". Fluorescence Microscopy in Life Sciences. Bentham Science Publishers. pp. 61–95. ISBN 978-1-68108-519-7. Retrieved 24 December 2017.
  2. ^ Rietdorf J (2005). Microscopic Techniques. Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology. Berlin: Springer. pp. 246–9. ISBN 3-540-23698-8. Retrieved 2008-12-13.
  3. ^ 3.0 3.1 sien RY; Waggoner A (1995). "Fluorophores for confocal microscopy". In Pawley JB. Handbook of biological confocal microscopy. New York: Plenum Press. pp. 267–74. ISBN 0-306-44826-2. Retrieved 2008-12-13.
  4. ^ Lakowicz, JR (2006). Principles of fluorescence spectroscopy (3rd ed.). Springer. p. 954. ISBN 978-0-387-31278-1.
  5. ^ Liu, J.; Liu, C.; He, W. (2013), "Fluorophores and Their Applications as Molecular Probes in Living Cells", Curr. Org. Chem.17: 564–579, doi:10.2174/1385272811317060003
  6. ^ Juan Carlos Stockert, Alfonso Blázquez-Castro (2017). "Chapter 4 Fluorescent Labels". Fluorescence Microscopy in Life Sciences. Bentham Science Publishers. pp. 96–134. ISBN 978-1-68108-519-7. Retrieved 24 December 2017.
  7. ^ Taki, Masayasu (2013). "Chapter 5. Imaging and sensing of cadmium in cells". In Astrid Sigel; Helmut Sigel; Roland K. O. Sigel. Cadmium: From Toxicology to Essentiality. Metal Ions in Life Sciences. 11. Springer. p. 99115. doi:10.1007/978-94-007-5179-8_5