תעלות מרצפות

מתוך ויקיפדיה, האנציקלופדיה החופשית
קפיצה אל: ניווט, חיפוש

תעלות מרצפות היא שיטת ריצוף DNA בשלבי פיתוח המבוססת על חדירת הגדילים המרוצפים דרך ממברנה טבעית או מלאכותית בעלת חריר בקוטר של ננומטרים בודדים (תעלה יונית) הנמצאת בתוך תמיסה פיזיולוגית. מדידת שינויים חשמליים בתמיסות בין שני צדדי הממברנה או בחריר עצמו- התלויים בסוג הבסיס החודר, מאפשרת את זיהוי הבסיס החודר, באופן זה ניתן לרצף את הגדיל השלם.

תעלה מרצפת במשטח גרפן: ה-DNA אשר חודר דרך הננו-נקבובית גורם לשינוי במעבר האלקטרוליטים בין שני צידי הממברנה. שינוי זה הוא ספציפי לכל בסיס ובסיס ברצף, רישום השינוי האלקטרוכימי מאפשר לפענח את רצף הבסיסים החודר.

היסטוריה[עריכת קוד מקור | עריכה]

הרעיון של ריצוף דנ"א בשיטת תעלות מרצפות הוצע בתחילת שנות ה-90 של המאה ה-20‏[1][2]בידי שתי קבוצות שעבדו באופן עצמאי: האחת בראשות Mark Akeson והשנייה בראשות Jens Gundlach. שתי הקבוצות גילו שניתן להעביר מולקולת דנ"א יחידה דרך תעלה חלבונית ביולוגית וכי זרם יונים שנמדד מהתעלה המרצפת בעת מעבר המולקולה דרך התעלה נותן מידע על רצף הנוקלאוטידים של המולקולה.

רישום ללא מתח בין שני צדדי הממברנה.
רישום לאחר השראת מתח בין שני צדדי הממברנה.
רישום ההפרעה בעת מעבר בסיס אחד דרך התעלה הביולוגית.

שיטת תעלות מרצפות[עריכת קוד מקור | עריכה]

עיקרון הריצוף בעזרת תעלות, מבוסס על כך שדנ"א חד-גדילי עובר דרך תעלה, והזרם היוני הנמדד, מעיד על סוג הנוקלאוטיד (אדנין (A), ציטוזין (C), גואנין (G) או תימין (T)) העובר בתעלה ברגע זה.

ריצוף בעזרת תעלות נעשה על ידי זיהוי האות החשמלי שנמדד מהתעלה בעזרת רישום אלקטרופזיולוגי של מתח הממברנה. האות החשמלי הוא פונקציה של הזרם היוני, המעיד על סוג הנוקלאוטיד‏[3][4].

ישנם שלושה עקרונות חשובים לביצוע מדידות אלקטרופזיולוגיות באמצעות תעלה:

  1. מעבר יונים דרך התעלה כתלות במעבר הבסיסים דרכה.
  2. התעלה צריכה להיות מספיק גדולה בשביל להכיל גם את המולקולה הנמדדת וגם את היונים שעוברים בתוכה. יש להתחשב גם בתכונות הידרו-דינמיות של היונים.
  3. על הרישום להיות רגיש מספיק ובעל יחס אות-רעש סביר בשביל לדווח על ההבדל הקטן ביותר במולקולות הדנ"א שעוברות אנליזה, לדוגמה: היכולות להבחין בין מולקולות דנ"א בעלות מתילציה לבין כאלו החסרות אותה.

מעבר היונים בתוך התעלה הוא מהיר יותר מהמעבר של המולקולה הנמדדת. בכל 1μs (מיקרו-שנייה) של מעבר נוקלאוטיד ממולקולת הדנ"א בתוך התעלה מתקבל זרם של 20pA (פיקו-אמפר), שהוא שווה ערך למעבר של 124 יונים. כאשר מופיע זרם בתוך הממברנה שמכילה את התעלה, מתרחשות באלקטרודות שתי תגובות אלקטרוכימיות הפיכות:

  1. תגובת חמצון בצד של האנודה : Ag(s)+Cl- −→AgCl(s)+e-‎.
  2. תגובת חיזור בצד של הקטודה: AgCl(s)+e- −→Ag(s)+Cl-‎.

בממברנה, היונים משתתפים גם ביצירת האות החשמלי הנמדד מהתעלה וגם ביצירת סיגנל הרעש. המדידה בתעלה מתקבלת בעקבות היונים שעוברים בתוך התעלה ומשלימים את המעגל האלקטרוכימי. לכל אחד מהנוקלאוטידים ישנה תגובה אופיינית לו, כלומר נמדד זרם שונה מהתעלה. כאשר נוקלאוטידים מסוג פורין יעברו בתוך התעלה נקבל סיגנל עמוק יותר ממעבר של נוקלאוטידים מסוג פרמידנים בתוך התעלה[3][5].

סוגים של תעלות מרצפות[עריכת קוד מקור | עריכה]

מבנה של תעלה ביולוגית

הסוגים העיקריים של ריצוף בעזרת תעלות הם- התעלות הביולוגיות (Biological nanopores) ותעלות במצב מוצק[5] (solid-state nanopores).

תעלות ביולוגיות[עריכת קוד מקור | עריכה]

התעלות הביולוגיות (Biological nanopores) הן חלבונים היוצרים נקבוביות בממברנה שומנית, דרכן יכולות לעבור מולקולות דנ"א. לתעלות הביולוגיות מספר יתרונות לאנליזת מולקולת דנ"א בודדת:

  • תאים יכולים לייצר מספר רב של תעלות, בדיוק אטומי העולה על ייצור תעלות בדרך התעשייתית.
  • הגודל וההרכב של התעלות יכול להשתנות על פי הצורך.
  • ניתן להתאים את המאפיינים הכימיים והפיזיים של התעלות לפי השימוש הנצרך.

אחד מהחלבונים הנפוצים בסוג זה של תעלות הוא (a-hemolysin pore (a-HL שקוטרו הפנימי הוא כ- 2 ננומטר (2nm). תעלה זו מורכבת מ-7 תת-יחידות מונומריות, שהופקה מ-Staphylococcus aureus. ייחודה של התעלה, מתבטא בכך שהיא נותרת פתוחה ב- pH נייטרלי ובמתח יוני גבוה.

תעלות במצב מוצק[עריכת קוד מקור | עריכה]

תעלות במצב מוצק (solid-state nanopores) עשויות לרוב מסיליקון, כאשר הסיליקון הנפוץ ביותר הוא סיליקון ניטריד. דרך ייצור התעלות, נעשה בשיטות שונות, כמו פיסול בעזרת קרן יונים ואלומות אלקטרונים. תעלות מסוג זה, יוצרו לראשונה ב- 2001, והפכו לאלטרנטיבה זולה ויעילה לתעלות הביולוגיות. היתרונות בשיטה הזו הן:

  • היכולת להתאים את הגודל והצורה של התעלה לפי הצורך, בדיוק רב.
  • לתעלות אלו עמידות רבה לאורך זמן.
  • היכולת לייצר אותן בצפיפות גבוהה, תוך התאמה מעולה של מאפיינים מכניים, כימיים ותרמיים לעומת תעלות ביולוגיות.
  • תעלות אלו מאפשרות שילוב עם טכנולוגיית קריאת בסיסים אופטית ואלקטרונית‏[6][7][8] .

יתרונות השיטה[עריכת קוד מקור | עריכה]

ריצוף בעזרת תעלות מרצפות מאפשר לרצף מקטעי דנ"א ארוכים. יתרון זה יאפשר בעתיד לרצף מולקולת דנ"א גנומית בזמן קצר ובאופן יעיל תוך כדי קבלת מידע על שינויים שחלו ברצף הגנטי כמו מקטעים שהוספו, מקטעים שהוסרו וכו'. למעשה, ריצוף בשיטה זו אינו מוגבל באורך הדנ"א. לשיטה זאת יתרון נוסף שכן, ניתן להשתמש בתעלה אחת לסוגים רבים של מולקולות דנ"א, כלומר השיטה אינה ספציפית אלא גנרית ולכן אינה דורשת הכנות מוקדמות, הגברה של המקטע וכו'‏[9][10]. יתרונותיה העיקריים של השיטה הם מהירות הריצוף ועלותו הנמוכה, הואיל והשיטה אינה דורשת שימוש באנזימים, כגון דנ"א פולימרז או בנוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית, אך חסרונה העיקרי הוא אחוז שגיאה גבוה.

ייעול עתידי של המערכת[עריכת קוד מקור | עריכה]

נניח כי קיימת תעלת מרצפת אידאלית שניתן להעביר בה מולקולת דנ"א. התעלה לא יוצרת אינטראקציה חזקה עם הדנ"א היא רק רחבה מספיק בשביל להכיל את מולקולת הדנ"א ואת זרם היונים שעובר בתוכה במהלך ריצוף הדנ"א. בנוסף, כל נוקליאוטיד מספק זרם יונים שונה במהלך מעבר בתוך התעלה. השאלה שעולה מתוך הנחה זאת ונשאלה על ידי חוקרים בנושא זה על מנת לפתח את הנושא ולהפוך את החזון למציאות: האם תעלה יונית מסוגלת באופן ישיר לרצף גדיל של מולקולות דנ"א? על מנת שהחזון יהפוך למציאות יש להתמודד ולהמשיך לחקור את הקשיים שעלו בדרך.

מעבר מונחה מתח של פולינוקליאוטיד בתוך התעלה הוא מאוד פשוט, עדיין התנאים המיקרוסקופים של המעבר של הגדיל בתוך התעלה לא נשלטים באופן מלא בגלל מגבלות פנימיות של תהליך ההעברה בתוך התעלה. לדוגמה, תהליך הדיפוזיה הטבעית לתוך התעלה עדיין לא נחקר באופן משמעותי מספיק בשביל להגיע למסקנות לגבי תהליך זה. בנוסף, תהליך המעבר של המולקולה הוא מהיר מאוד וכמעט בלתי ניתן למדידה. הפחתת המתח של המעבר מגדיל את זמני המעבר הממוצעים, אך תהליך הדיפוזיה (שמגביר את הרעש של המערכת) הופך לאיטי יותר אך גם לתהליך פחות מבוקר ומסודר. תוצאה זאת משאירה את החוקרים עם מידע בלתי מספק לקביעת רצף גדיל הדנ"א מסיבות שאינן בשליטתם.

בשביל לנסות ולפתור את בעיית המעבר ניסו להשתמש בדופלקס של דנ"א לא מזווג. הקינטיקה של התהליך צריכה להיות יותר מבוקרת בעזרת בחירת מתח התעלה וגודל הדופלקס. למרות זאת, דנ"א לא מזווג לא יכנס לתוך התעלה בסיס אחר בסיס בשל המבנה של הדופלקס שהוא מבנה יציב יותר הבנוי מכמה נוקלאוטידים אשר לא מאפשרים את המעבר בתוך התעלה באופן של בסיס אחר בסיס. המסקנה הנ"ל מצריכה את החוקרים להרחיב את החומצות האמינו הפנימיות וכתוצאה מכך זמן הריצוף מתארך. משימה זאת יכולה להיות מאתגרת מאוד בעיקר מהסיבה שיש את הצורך להגדיל את הפוטנציאל של התעלה המרצפת לקרוא מקטעים ארוכים יותר ולאורך זמן ארוך יותר.

השימוש בשיטה של "צעד מוטורי תלוי אנזים" היא עוד דרך לויסות המעבר בתוך התעלה. לפי שיטה זאת האנזים דנ"א פולימראז משמש בשביל להניע את גדיל הדנ"א הבודד להיכנס לתוך התעלה בסיס אחד בכל פעם, כך שגדיל הדנ"א נמשך לתוך התעלה בעזרת כוחות חשמליים. למעשה התהליך הוא סימולטני בעוד שהדנ"א פולימראז מפלמר את גדיל הדנ"א מנקלאוטידים אשר בתמיסה הגדיל עצמו "משתחל" דרך התעלה המרצפת, בכל פעם שהאנזים משלב נוקליאוטיד לשרשרת, נוקליאוטיד אחד נדחף לתוך התעלה. ניתן לבקר את היעילות של האנזים בעזרת שינוי הריכוז של הנוקלאוטידים בתמיסה, שינוי המתח או בחירה של אנזים פולימראז שונה ויותר יעיל למדידה. היתרון של "צעד מוטורי תלוי אנזים" יכול להוות התקדמות גדולה תחום ולהוות פתרון יעיל לריצוף מולקולת דנ"א ארוכה במעט זמן ובכמה שפחות משאבים[3].

ראו גם[עריכת קוד מקור | עריכה]

קישורים חיצוניים[עריכת קוד מקור | עריכה]

הערות שוליים[עריכת קוד מקור | עריכה]