מיקרוסקופיה ברזולוציית-על – הבדלי גרסאות

תוכן שנמחק תוכן שנוסף

בשורה

גרסה מ־15:23, 11 ביוני 2017

מיקרוסקופייה ברזולוציית על - היא שם כולל לטכניקות שונות המאפשרות קבלת תמונה של מבנים ברזולוצייה הגבוהה מהרזולוציה של מיקרוסקופיית אור, אשר מוגבלת על ידי דיפרקציה. המיפוי העדין של מבנים תאיים חושף מידע ביולוגי רב יותר כאשר המבנים אינם מוגבלים על ידי דיפרקציה, ועל כן ניתן לקבל תמונה חדה וברורה יותר, ברמת תתי האברונים.

מיקרוסקופייה ברזולוציית על מציעה טכניקות שונות כדי להגיע לרזולוציות שבעבר רק מיקרוסקופ אלקטרוני יכול היה להגיע אליהם, תוך כדי יישום של היתרונות השונים בשיטות במערכות ביולוגיות.

רקע

חלק גדול מהידע של תהליכים ביולוגים ברמת התאים ותתי-התאים נבע מהיכולת לתאר אותם אותם בצורה ישירה. בין הטכניקות המיקרוסקופיות השונות, מיקרוסקופיה פלואורוצנטית היא טכניקה נפוצה בגלל שני יתרונות עיקריים: ניתן לצפות בחלקים ספציפיים של התא בעזרת ניתוח המבנה המולקולרי שלו, ומיקרוסקופיית אור מאפשרת לצפות במבנים תאיים בזמן אמת. בהשוואה לטכניקות הדמייה אחרות כגון מיקרוסקופ אלקטרוני, מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונאלי מוגבל על ידי רזולוציה מרחבית נמוכה יחסית, בשל אינטראקציות בין האור הנראה לבין הסביבה הקרובה והעקיפה של האור.
אפשר להסתכל על מיקרוסקופ אופטי כאל מערכת של עדשות המייצרות תמונה מוגדלת של עצם קטן. בתהליך זה, קרני אור היוצאות מכל הנקודות בעצם מתכנסות לנקודה אחת במישור התמונה. עם זאת, דיפרקציה של האור מונעת את ההתכנסות המדויקת של הקרניים, מה שגורם לנקודה באובייקט להיות מתורגמת לנקודה מטושטשת בגודל סופי בתמונה. ההתפלגות התלת מימדית של עוצמת התמונה של עצם נקודתי נקראת פונקציית התפלגות נקודתית (Point Spread function – PSF). הגודל של הPSF קובע את הרזולוציה של המיקרוסקופ: כאשר המרחק בין שתי נקודות קטן יותר מהרוחב חצי מקסימום (FWHM) של הPSF, תתקבל חפיפה בין תמונות שתי הנקודות הגורמת לאיבוד מידע בתמונה.

הFWHM של ה-PSF בכיוון הרוחבי (בציר הxy המאונך לציר אופטי) מוערך כ- Δxy ≈0.61λ/NA, כאשר λ הוא אורך הגל של האור, ו NA הוא המפתח הנומרי של המטרה המוגדר כ- NA = nsinα, כאשר n הוא מקדם השבירה של התווך ו- α הוא הזווית של חצי קונוס האור הממוקד היוצא מהמטרה ^[1]. האורך של הPSF גדול פי 2-3 גדול מרוחבו עבור עצמים עם מפתח נומרי רגיל. כאשר עורכים הדמייה בטווח האור הנראה (λ ≈ 550 ננומטר), עבור מטרה קטנה בעלת מפתח נומרי NA = 1.40 יתקבל PSF ברוחב שקרוב ל 200 ננומטר ואורך הקרוב ל ל500 ננומטר . עבור עצמית הגדולים מרזולוצייה זו, למשל האיברים והרקמות, מגבלת הדיפרקציה אינה משמעותית, עם זאת, כאשר מתמקדים בתאים, אשר בהם מספר רב של מבנים תת-תאיים הקטנים מאורך הגל של האור ויכולים להגיע לממספר ננומטרים, מגבלת הדיפרקצייה הופכת להיות מכשול להבנת מבנים אלו. מכאן נבע הצורך לפיתוח טכניקות חדשות המאשרות צפייה ברזולוצייה גבוהה יותר.

ישנן שתי קבוצות עיקריות של שיטות:

רזולוציה-על דטרמיניסטית (Deterministic super-resolution): פלואורופור – הכימיקל ההנפוץ ביותר בשימושים של מיקרוסקופ ביולוגי, מגיב בצורה לא ליניארית לעירור, וניתן לנצל תגובה זו על מנת לשפר את הרזולוציה.

רזולוציית-על סטוכסטית (Stochastic super-resolution): ההרכב הכימי של מקורות אור מולקולריים רבים מאופיינת בהתנהגות מורכבת, וניתן להשתמש בהם כדי לגרום לפלואורופורים שונים לפלוט אור בזמנים שונים, ועל ידי כך להבין את המבנה הפנימי של הדגימה.

השיטות השונות

מיקרוסקופייה ברזולוציית על באמצעות תבנית עירור מרחבית (SPATIALLY PATTERNED EXCITATION):

בשיטה זו, על מנת להגיע לרזולוצייה גבוהה יותר מהרזלוציה שמוגבלת על ידי דיפרקציה, משתמשים במאפיינים השונים של תבנית העירור על מנת שניתן יהיה לחלץ מהם מידע בסדר גודל קטן שמתורגם לרזולוציית-על. גישה זו נקראית "תבנית עירור מרחבית", הכוללת חלק מהשיטות הבאות:

מיקרוסקופייה בשיטת דיכוי באמצעות פליטה מאולצת (Stimulated emission depletion microscopy - STED):

עיקרון הפעולה של STED הוצע לראשונה בשנת 1994 ^[2], ולאחר מכן הוכח בניסוי ^[3]. עקרון הפעולה הכללי הוא שימוש בלייזר (לייזר STED) על מנת לדכא את הזהירה של פלואורופורים הממוקמים מחוץ למרכז הפוקוס. דיכוי הזהירה מושג על ידי פליטה מאולצת: כאשר פלואורופור מעורר נפגש עם פוטון המתאים להפרשי האנרגיה בין מצב היסוד למצב המעורר, הוא יכול לחזור לרמת היסוד בעקבות הפליטה המאולצת, לפני שמתבצעת פליטה פלואורוסנטית ספונטנית. תהליך זה גורם לדיכוי הזהירה של הפלואורופורים.

על מנת לחדד את התמונה בעזרת שימוש בSTED, הלייזר צריך להיות בעל תבנית של עוצמה המתאפסת במרכז הפוקוס, ועוצמה גדולה יותר ביתר האזורים. למרות זאת, תבנית זו מוגבלת גם היא על ידי דיפרקציית האור, לכן האפקט של STED לבדו אינו מספיק. המפתח להשגת רזולוציית על הוא התלות הלא ליניארית של דלדול הזהירה בעוצמה של לייזר הSTED, קרוב למצב הרווייה של הלייזר. אם העוצמה המקומית של לייזר הSTED גבוהה מרמה מסויימת, תדוכא הזהירה. על ידי הגברת עצמת הלייזר, גדל האיזור בו הזהירה מדוכאת, ללא השפעה משמעותית על הזהירה בנקודת הפוקוס, כיוון שבנקודה זו עצמת לייזר הSTED קרובה ל 0. כתוצאה מכך, ניתן להבחין בזהירה רק באיזור קטן סביב נקודות הפוקוס, דבר המשפר את רזולוציית התמונה. גודלו של אזור זה מוגבל על ידי עצמת לייזר הSTED, במקום להיות מוגבל על ידי דיפרקציית האור. בדרך זו ניתן לקבל תמונות ברזולוציות גבוהות, ורמת הטשטוש קטנה.

מיקרוסקופייה בשיטת ההארה התבניתית (Structured illumination microscopy - SIM):

בשיטה זו מופעלת תבנית הארה על הדגימה, כאשר התדרים המרחביים של תבנית ההארה מתערבבים עם התדירויות הנפלטות מהדגימה, וכך תדירויות גבוהות מתורגמות לתדירות נמוכות, אשר ניתנות להבחנה במיקרוסקופ.

ניתן לקבל תבנית ההארה מחזורית על ידי התאבכות של מקורות אור בכיוון הרוחבי, הצירי, או שילוב של שניהם. לאחר קבלת מספר רב של תמונות באמצעות סריקה וסיבוב של תבניות ההארה, ניתן לשחזר את מבנה הדגימה ולקבל תמונה ברזולוציית על. בגלל שתבנית ההארה עצמה מוגבלת אף היא על ידי דיפרקציית האור, שיפור הרזולוצייה במיקרוסקופיית SIM מוגבל לעד פי 2, על ידי שילוב של שני מקורות אור המוגבלים על ידי דיפרקציה. רזולוציה רוחבית של ~ 100 ננומטר ורזולוציה צירית של ~ 300 ננומטר הושגה בשיטה זו.

מיקרוסקופייה בשיטת רווית ההארה התבניתית (Saturated structured illumination microscopy - SSIM) מבוססת על שיטת SIM. עיקרון פעולתה הוא הבאת הפליטה הספונטנית לרוויה, כאשר פלואורופור מואר בעצמה גבוה של אור מעורר ^[4]. תחת תנאים אלו, בכל פעם שהפלואורופור מגיע לרמת היסוד, הוא מייד קופץ לרמה המעוררת. כתוצאה מכך, כאשר עצמת הזהירה של הפלואורופור מתקרבת לרוויה, היא כבר לא פרופורציונלית לעצמת האור הנפלט מהעירור. בSSIM, הדגימה מוארת באור מעורר ועצמתי בעל תבנית סינוסיאלית, כך ששיאי התבנית מדוכאים על ידי זהירת הפלואורופורים הנמצאים במצב הרוויה, ואילו בנקודות האפס, האיזור בו הפלואורופור יורד לרמת היסוד, אין זהירה, לכן אין השפעה על התבנית. האפקטים הללו מוסיפים תדרים מסדר גבוה יותר לתבנית העירור.בשיטה זו, הרזולוצייה המרחבית כבר לא מוגבלת על ידי עקיפת האור, אלה רק על ידי הרוויה של הפליטה הפלואורוסנטית ^[5].

רזולוציית-על בשיטת מיקום מולקולה יחידה (Single-Molecule Localization Methods -SMLM):

מבנה ביולוגי מוגדר על ידי מיקום המולקולת המרכיבות את המבנה. באופן דומה, תמונה פלואורסצנטית מוגדרת על ידי הקואורדינטות המרחביות של הפלואורופורים היוצרים את התמונה. אפשר לנצל זאת, ועל ידי מציאת מיקום הזהירה במדגם ברמת דיוק גבוהה ניתן להגיע לרזולוציית-על. למרות שהתמונה המתקבלת מפלואורופור בודד היא נקודה בגודל סופי, קביעת מיקום הפלואורופור מהתמונה המתקבלת יכולה להיות מדוייקת הרבה יותר מגבול הדיפרקציה, כל עוד התמונה מתקבלת ממספר רב של פוטונים אשר נפלטים מהפלואורופור. אפשר להתייחס להרכבת תמונה בעזרת N פוטונים כאל מדידת מיקומם של N פלואורופורים, עם אי ודאות המוערך ע"י ^[6] Δloc≈ Δ/√N כאשר Δloc הוא אי ודאות המיקום, וΔ הוא אי ודאות של מדידת מיקום בודדת. קנה מידה זה מאפשר מיקרוסקופייה ברזולוציית על, אשר לא מוגבלת על ידי דיפרקציית האור. מדידה בדיוק גבוה של מקורות אור, כמו חלקיקים פלואורוצנטים, נפוצה בניסויים ביופיסיקליים ^[7], והגיע לרמת דיוק שקרובה ל 1Å ^[8](אנגסטרום).

על ידי זיהוי והדמייה של מולקולה בודדת, הצליחו להגיע בניסויים לרמת דיוק של ננומטרים בודדים. עם זאת, נוצרת בעיה כאשר מספר מולקולת נמצאות בסמיכות, ורמת הדיוק יורדת בצורה דרסטית, כיוון שהתמונות המתקבלות מהפלואורופורים חופפות. ניתן להפריד את האותות המתקבלים ממולקולות בעלי תמונה חופפת על ידי ניתוח ספקטרום הבליעה והפליטה הייחודי לכל מולקולה ^[9], הפרדה בזמן, ומספר שיטות נוספות .עם זאת, מסובך יותר להגיע לרמות דיוק גבוהות יותר המוגבלות על ידי דיפרקציית האור בעזרת שיטות אלו.

דגימה ביולוגית-פלואורוצנטית אופיינת מכילה אלפי, או אפילו מיליונים פלואורופורים בצפיפות גבוהה, דבר המקשה על קבלת תמונה ברורה בשיטת הSMLM. על ידי שימוש בגשושיות פלואורוצנטיות הניתנות לשליטה (photoswitchable probes), היכולות להחליף בין מצב חשוך למצב פולט אור, אפשר לחלק את תמונת הזהירה המתקבלת לתחומי זמן שונים, כך בעיית התמונה החופפת שמתקבלת ממולקולות שונות ניתנת לפיתרון. בשיטה זו, מולקולות הנמצאות בתחומי דיפרקציית האור יכולות להיות להיות "מצולמות" בנקודות זמן שונות, כך שעבור מולקולות חופפות, ניתן לצלם מולקולה מסויימת, לאחר מכן "לכבות" את המולקולה ולצלם את המולקולה הבאה, כך שהתמונה הכוללת המתקבלת כבר לא תהיה מוגבלת על ידי החפיפה. מיקום מקבילי מושג על ידי הדמיית שדה רחב, כך שקואורדינטות הפלואורופורים ממופות, ונבנית תמונה ברזולוציית על. שיטה זו תוכננה ויושמה באופן עצמאי על ידי שלוש מעבדות, והיא קיבלה את השמות STORM PALM ו- FPALM בהתאמה. שלושת המעבדות השתמשו בתחילה בצבעים פלואורסצנטיים או חלבונים שיכולים להיות מופעלים על ידי אור באורך גל שונה מאור ההדמיה ,המעורר את זהירתם ומנטרל את הפלואורופורים. הפרדה זאת מאפשרת שליטה על כמות המולקולות הנמצאות במצב פלואורסצנטי מסויים בזמן נתון, כך שהמולקולות המופעלות ניתנות להפרדה ומיקומם מתקבל. חזרה על התהליך מאפשר למפות את מיקומי הפלואורופורים בדיוק רב, ולקבל תמונה ברזולוציית על.

המאפיינים הפיזיים והכימיים של הגשושיות הפלואורצנטיות קריטיים לקבלת תמונה ברזולציית על בשיטת הSMLM. עד כה נעשה שימוש במספר גדול של פלואורופורים הניתנים לשליטה על ידי אותות אופטיים. הגשושיות הללו יכולות להיות עשויות ממגוון רחב של חומרים, החל מצבעים אורגנים עד לחלבונים פלואורוסנטים, המאפשרות סיווג של דגימות ביולוגיות בעזרת מגוון של שיטות. הרזולוציה של טכניקה זו מוגבלת על ידי מספר הפוטונים שנקלטו בכל אירוע של פליטת אור מהגשושיות, אשר משתנה ממאות עבור חלבונים פלואורוצנטים, עד אלפים עבור צבעים אורגניים מסוג ציאנין, כגון Cy5 ^[10]. מספרים אלה מאפשרים שיפור של יותר מסדר גודל אחד ברזולוצייה המרחבית של המיקרוסקופ. בפועל, חוקרים הצליחה להגיעה לרזולוציה רוחבית של 20 ננומטר באמצעות שימוש בגשושיות ציאנין ^[11]. שיטה זו אפשרה להגיע לרזולוציות גבוהות בחקר מבנה הDNA ומבנה החלבונים השונים המרכיבים אותו, בנוסף למבנים תאיים אחרים^[12].

התקדמויות אחרונות במיקרוסקופייה ברזולוציית על

בשנים האחרונות נעשתה התקדמות בתחום של רזולוציית על, המאפשרת יישומים חדשים בדגימות ביולוגיות. ההתקדמות הטכנית הזו התאפשרה באמצעות פיתוח השיטות של הדמייה אופטית וגשושיות פלואורצנטיות.

הדמייה מרובת צבעים:

קבלת תמונה של מבנה ביולוגי חשובה על מנת להבין את את הפונקציונליות שלו, אך אין זה תמיד מספיק כיוון שתהליכים ביולוגיים רבים מעורבים באינטראקציות בין מבנים ותתי מבנים שונים. אחת מהדרכים להתמודד עם אינטראקציות אלה היא באמצעות שימוש במיקרוסקופיה מרובת צבעים, בה מרכיבים שונים במבנה מסומנים בצבעים שונים. הצבעים השונים בתמונה משמשים כאינדיקטורים לאינטראקציות אפשריות, אך רמת הדיוק בשיטה זו מוגבלת על ידי הרזולוצייה של שיטת ההדמייה. הדמייה מרובת צבעים ברזולוציית על מאפשרת לקדם באופן ניכר את ההבנה של אינטראקציות מולקולריות בתאים.

הדמיה מרובת צבעית בשיטת תבנית העירור המרחבית:

הדמייה מרובת צבעים בשיטת STED ניתנת לביצוע באמצעות פלואורופורים בעלי דרגת עירור ופליטת אורך גל שונה. על מנת לקבל הדמייה מרובת צבעים, יש להשתמש בלפחות שני סוגי פלואורופורים. באמצעות שימוש בזוג צבעים פלואורוסנטים ואלומות לייזר STED, ניתן לקבל הדמייה של קולוקליזציה (Colocalization) בין אשכולות החלבון הסינפטי והמיטוכונדריה, ברזולוציה שמגיעה ל 5 ננומטר ^[13]. שימושים נוספים בשיטה זו איפשרו לדמות את קרום הממברנה החיצוני של המיטוכונדריה בשלושה מימדים^[14].

הדמיה מרובת צבעית בשיטת הSMLM:

המפתח להדמיה רב צבעית בשיטת מיקום מולקולה יחידה היא להבדיל בין התכונות של כל אחת מהגשושיות הפלואורסנטיות. מלבד פליטה של גל כתוצאה מעירור, אורך הגל המשמש להפעלה יכול לשמש כחתימה של הפלואורופורים. לכן הדרישה המוקדמת של הדמייה בשיטה זו היא שהגשושיות הפלואוסנטיות הניתנות לשליטה יהיו בעלי אורכי גל שונים עבור עירור, פליטה או הפעלה, דבר המאפשר הבדלה ביניהם. גשושיות אלו נוצרו על בסיס צבעים אורגנים-פלואורוסנטים מסוג ציאנין. הגשושיות מורכבות מפלואורופור "מדווח", שיכול להפוך לחשוך כאשר מעורר על ידי אור ההדמיה, ופלואורופור "מפעיל", אשר מאפשר את ההפעלה של הפלואורופור ה"מדווח" כאשר מואר על ידי אור באור גל מתאים. צבעי ציאנין בתחומים שונים החל מאדום כהה עד אינפרא-אדום, מתפקדים כ"מדווחים" הניתנים לשליטה, וגם לצבעי הציאנין עבור ה"מפעילים" יש מגוון רחב של אפשרויות, החל מסגול ועד צהוב. שילוב של "המדווחים" וה"מפעילים" יוצר מגוון רחב של גשושיות פלואורצנטיות הנבדלות באורכי גל ההפעלה והפליטה. הדמיה תלת-צבעית של מולקולות DNA, הדמיה דו-צבעית של מיקרוטובולים בתאים והדמיה דו-צבעית תלת-ממדית של מיקרוטובלים ומיטוכונדריה הושגו באמצעות שיטה זו ^[15]

הדמיית תאים חיים:

אחד מהייתרונות של מיקרוסקופיית אור הוא היכולת ליצור הדמייה של תאים חיים. ישנן שתי דרישות עיקריות על מנת לערוך הדמיית תאים חיים: יש לסווג את התאים, ולוודא שרזולוציית הזמן גבוהה מספיק כדי לעקוב אחרי התנועות בתא. השיטות ברזולוציית על שיושמו עד כה, כולללות, את שיטת תבנית העירור המרחבית ושיטת מיקום המולקולה היחידה. שתי שיטות ההדמייה איטיות באופן יחסי. האחרונה כרוכה בהכנסת גשושיות הניתנות לשליטה באמצעות אותות אופטיים לתאים חיים, מה שמוסיף אתגר נוסף. עם זאת, מספר רב של חומרים התגלו כניתנים לשליטה על ידי אותות אופטיים.

הדמיית תאים חיים בעזרת שיטת תבנית העירור המרחבית:

בגלל שהרזולוציה בשיטת STED גדולה הרבה יותר מאשר שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית, כך הזמן הדרוש לביצוע סריקה של דגימה גם הוא ארוך יותר בצורה משמעותית. באמצעות הגדלת זמן הסריקה והגבלת שדה התמונה למספר מיקרו-מטרים, הצליחו לצפות בתנועה בראונית של חלקיקים בגודל של מספר ננומטרים בקצב של 80 פריימים לשנייה. לאחרונה הצליחו מדענים לדמות נוירונים בהיפוקמפוס ולהבחין בתנועת שלפוחית סינפטית בודדה ברזולוציה של 60-80 ננומטרים^[16].

הדמיית תאים חיים בשיטת ה SMLM:

הדמיה ברזולוציית-על בשיטת הSMLM גם היא איטית יחסית, כיוון שהתמונה הסופית היא למעשה מפה של מיקומי הפלואורופורים שהצטברו על פני מחזורים רבים. הדמייה ברזולוצייה גדולה מגבול הדיפרקציה של חלבוני אדהזיה פוקלים (focal adhesion proteins) הושגה לאחרונה ^[17]. בעזרת חלבון פלואורסצנטי הניתן לשליטה באמצעות אותות אופטיים (EosFP), הצליחו לקבל הדמייה ברורה של החלבון פקסילין . רזולציית הזמן אשר הושגה הייתה בין 25–60 פריימים לשנייה, ובמהלך פרק זמן זה, הופעלו כ103 פלואורופורים בכל מיקרומטר מקובע, והושגה רזלוצייה של 60-70 ננומטר. לאחרונה הצליחו להכניס חלבון פלואורוסנטי צהוב הניתן לשליטה לתוך תא בקטרייה חי, דבר האפשר מעקב אחרי חלבון הMreB.

גשושיות פלואורסצנטיות יכולות להקל מאוד על מעקב אחר החלקיקים. בניגוד לניסויים קונבנציונאלים של מעקב אחרי חלקיק יחיד, שבו מתבצע סיווג ומעקב רק אחר חלק קטן של המטרות, השימוש בגשושיות הפלואורסצנטיות מאפשרות לעקוב אחר מטרות בצפיפות גבוהה יותר. למרות שניתן להפעיל את הגשושיות רק בחלק קטן של המבנים בזמן נתון, לאחר מחזורי פעולה רבים מתקבלת מפה מפורטת של מסלולי החלקיקים. גישה זו שימשה לבדיקת קיומם של מיקרו-מבנים בממברנה על ידי בחינת תכונות המפה המרחבית של החלבונים בממברנה^[18].

הדמייה תלת מימדית:

מרבית המבנים התאיים הם תלת מימדיים מטבעם, והיכולת לפענח מבנה תלת מימדי מוגבלת על ידי המימד בעל הרזולוצייה הנמוכה ביותר. מכאן נבע הצורך לפתח שיטות המאפשרות קבלת רזולציית על בשלושה מימדית.

הדמיה תלת מימדית בשיטת הSMLM זו יושמה לראשונה באמצעות שיטת אסטיגמציה למיקום הצירים ^[19]. בשיטה זו מוכנסת למכשיר עדשה גלילית, המאפשרת פוקוס שונה בכיווני x ו- y. כתוצאה מכך, התמונה המתקבלת מפלורופור יחיד הופכת לאליפטית, דבר המאפשר מדידה בו זמנית של המיקום הצירי (ציר Z) שלה מפחיסות האליפסה, ואת המיקום הרוחבי (ציר מישור XY) ממרכז התמונה .שיטה זו הגיעה לדיוק רוחבי של ~ 25 ננומטר ודיוק צירי של ~ 50 ננומטר. תיאור מלא של מבנים ביולוגים, לדוגמא הדמייה מלאה של תאי יונקים, הושגו באמצעות שיטה זו .

יישום נוסף של הדמיה תלת מימדית נעשה על ידי הדמייה בשני מישורים שונים, בהם האור הנפלט מהדגימה מפוצל ומגיע לאזורים שונים במצלמה. אורכי הדרכים השונות בהם עבר האור מאפשרים לקבוע את הקואורדינטות בציר Z, ובכך לקבל תמונה תלת מימדית ^[20].

רמת הדיוק של מיקרוסקופייה ברזולוציית על

שיטות מיקרוסקופיות מספקות יכולת לבחון את המבנה המרחבי של הדגימה ולראות כיצד הדגימה משתנה בזמן. הרזולוציה המרחבית ורזולוציית הזמן של הטכניקות קובעת באיזו רמת דיוק ניתן לראות את פרטי המבנה, ובאיזה מהירות ניתן לצפות בתהליך. כאשר מתקרבים לרזולוציות גבוהות, גורמים שונים מהווים בעיה ומורידים מהדיוק.

הרזולוציה האופטית:

הרזולוציה האופטית מהווה את היכולת הבסיסית של שיטות המיקרוסקופיה השונות לקבלת תמונת המבנים. ניתן להגדיר אותה כהיכולת להבחין בין שני מקורות נקודתיים קרובים. עבור שיטות תבנית העירור המרחבית, הרזולוצייה האופטית מיוצגת על ידי הגודל האפקטיבי של הPSF. עבור שיטות הSMLM, הדיוק של קביעית מיקום הגשושיות הפלואורוסנטיות הוא העיקרון של מדידת הרזולוצייה האופטית.

הרזולוציה האופטית בשיטת תבנית העירור המרחבית:

בשיטה זו, קבלת רזולוציית על מושגת על ידי יצירת תחום עירור בעל ממדים הקטנים בצורה משמעותית מאשר גבול העקיפה. עבור STED לדוגמא, החדות של הPSF נובעת מדיכוי הזהירה של פלואורופורים הממוקמים מחוץ למרכז הפוקוס. עם הגדלת עצמת הלייזר, האיזור של דיכוי הזהירה מתרחב ומתקרב אל נקודת הפוקוס, אך הפלואורופורים בנקודת הפוקוס אינם מושפעים ידי לייזר הSTED במידה ועצמת הלייזר נשמרת על אפס בנקודת הפוקוס. באופן תיאורטי, ניתן להגיע לרזולוצייה מרחבית בלתי מוגבלת אם תבנית דלדול העצמה סביב נקודת הפוקוס אידיאלית.

בפועל, תבנית דלדול העצמה היא לא אידאלית, ויכולה לנבוע ממספר רב של גורמים, המגבילים את רמת הרזולוצייה. לדוגמה, עצמת לייזר בנקודת הפוקוס של 1% מעוצמת השיא מאפשרת להגיע לשיפור של עד פי 7 ברזולוציה האופטית לעומת מיקרוסקופיה קונפוקלית, ואילו עבור עצמה של 0.1% בנקודת האפס ניתן להגיע לשיפור של עד פי 20 ^[21] ברזולוציה. לעצמת הלייזר בנקודת בפוקוס יש חשיבות דומה גם עבור SSIM.

הסיבות השונות שגורמות לתבנית דלדול לא אידיאלית, כוללות פגמים במצב הלייזר, אברציה כדורית הנגרמת ממקדמי השבירה השונים, וגורמים נוספים.

רזולוציה אופטית בשיטת מיקום מולקולה יחידה:

בשיטה זו קבלה של רזולוציית על מושגת באמצעות בדיקת המיקום של פלואורופורים בודדים בדיוק גבוה. מספר הפוטונים הנאספים מכל פלואורופור הוא הגורם העיקרי להגבלת הרזולוציה.

דרך קפדנית לאפיין את דיוק המיקום בשיטת הSLML הוא באמצעות בדיקת מיקום חוזרת של הפלואורופורים הניתנים לשליטה. לחלופין אפשר לקבל את הדיוק מההתפלגות של המיקומים שנמדדו על ידי מספר רב של גשושיות במבנה מוגדר היטב, למשל משטח שטוח המאפשר למדוד את הדיוק בציר Z. עבור צבעי הציאנין , דיוק המיקום אשר התקבל באופן ניסיוני הוא ~ 20 ננומטר לרוחב. לעומת זאת, הרזולוצייה התאורטית עבור צבעי ציאנין היא 6 ננומטר. סיבות אפשריות לפער בין הערך התאורטי לערך הנמדד הוא שהPSF של הפלואורופורים אינו פונקציה גאוסית מושלמת, התמונה המתקבלת מפלואורופור רוטט אינה סימטרית עקב פליטה הנובעת מהדיפול של הפלואורופור, גדלי הפיקסלים השונים במצלמה אינם זהים לחלוטין, יציבות המכשיר, ועוד. אם כן, צריך לקחת מספר רב של גורמים בחשבון בשביל להעריך נכונה את רזולוציית השיטה.

גורמים המשפיעים על הרזולוציה המרחבית:

הרזולוציה האופטית, כפי שפורט לעיל, מגדירה את הגבול של המבנה הקטן ביותר בו השיטה יכולה להבחין. כאשר עורכים הדמייה על דגימה ביולוגית, הרזולוצייה האפקטיבית מושפעת גם ממספר גורמים נוספים הכוללים את צפיפות המדגם, והגודל הפיסי של הגשושית.

צפיפות המדגם:

במיקרוסקופייה ברזולוציית-על, הרזולוצייה האופטית עשוייה להתקרב לגודל של המרחק בין גשושיות פלואורצנטיות סמוכות, לכן צפיפות המדגם יכולה להיות גורם המגביל את הרזולוציה המרחבית האפקטיבית. הגבלה זו חלה על כל שיטות המיקרוסקופייה ברזולוציית על. כאשר מספר המולקולות הממופות בדגימה אינו מספיק, מופיעים פגמים בתמונה, היכולים לגרום, לדוגמא, למבנה רציף להיראות כלא רציף.

מימדי הגשושיות:

גודלה של הגשושית מגביל את האופן שבו התמונה משקפת את המבנה בפועל. לדוגמה, עבור אימונופלורסנציה בלתי ישירה (indirect immunofluorescence), קשירת הנוגדנים הראשיים והמשניים (Primary and secondary antibodies) מגדיל את הקוטר של המיקרוטובול מ 25 ננומטר ל 60 ננומטר ^[22]. הפתרון האולטימטיבי של הבעיה היא שימוש בפלואורופורים אורגנים, המגיעים לגודל של ~ 1 ננומטר, כך שהשפעתם על תמונת המבנה פחות משמעותית.

יישומים נוספים במערכות ביולוגיות

הדמייה של מיקרוטובול בתא מסוג BSC-1. איכות התמונה בשיטת המיקרוסקופייה ברזולוציית על ניכרת.

בנוסף למבנים ביו-מולקולריים שנבחנו, כגון DNA, שימוש בשיטות התוארו לעיל נעשה גם על מספר רב של מבניים תאיים.

הדגימה הנפוצה בה משתמשים לחקר המיקרוסקופיה ברזולוציית על הוא שלד התא של יונקים, במיוחד המיקרוטובול. מבנים אחרים של שלד התא שצולמו עד כה כוללים סיבי אקטין של למליפודיום ^[23], סיבי ביניים של קרטין ^[12], נוירופילמנטים ועוד. הדמיות אלו מדגימות את היכולת של מיקרוסקופייה ברזולציית-על להבחין ולהבדיל בין סיבים שונים בחלבונים, כמו כן להבין את המבנה התלת-מימדי של שלד התא בתאים של יונקים.

לאברונים שונים, דוגמת הרשתית תוך-פלזמית, ליזוזום ומיטוכונדריה נעשתה הדמייה בעזרת השיטות שתוארו. לדוגמא, בשיטת מיקום המולקולה היחידה, ניתן היה לקבל תמונה ברורה של צורת ההמיספירה של הקלטרין ^[24], אשר מופיעים רק ככתמים במיקרוסקופ פלואורוסנטי קונבציואונלי. בעזרת שימוש בשיטת STED ניתן לראות את הצורה החלולה של הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה, ואת האינטראקציות שלהם עם המיקרוטובל ^[25].

ההדמיות בשיטות השונות של סוגי מבנים תאיים רבים מדגימות את היתרונות הרבים שיש למיקרוסקופיה ברזולוציית על על פני מיקרוסקופיה קונבנציאונלית.

הערות שוליים

^ Larry H. Bernstein, MD, FCAP, Development Of Super-Resolved Fluorescence Microscopy, pharmaceuticalintelligence.com, ‏October 12, 2014
^ Hell SW, Wichmann J., Breaking the diffraction resolution limit by stimulated-emission, Opt. Lett., 1994
^ Klar TA, Hell SW, Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy, Opt. Lett
^ Mats G. L. Gustafsson, Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 2005-09-13, עמ' 13081–13086 doi: 10.1073/pnas.0406877102
^ Super-Resolution Optical Microscopy – Ultrafast and Microspectroscopy Laboratories, uml.chemistry.unimelb.edu.au (באנגלית אמריקאית)
^ Russell E Thompson, Daniel R Larson, Watt W Webb, Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes., Biophysical Journal 82, 2002-5, עמ' 2775–2783 doi: 10.1016/S0006-3495(02)75618-X
^ R N Ghosh, W W Webb, Automated detection and tracking of individual and clustered cell surface low density lipoprotein receptor molecules., Biophysical Journal 66, May 1994, עמ' 1301–1318 doi: 10.1016/S0006-3495(94)80939-7
^ Elio A. Abbondanzieri, William J. Greenleaf, Joshua W. Shaevitz, Robert Landick, Direct observation of base-pair stepping by RNA polymerase, Nature 438, 2005-11-24, עמ' 460–465 doi: 10.1038/nature04268
^ Thilo D. Lacoste, Xavier Michalet, Fabien Pinaud, Daniel S. Chemla, Ultrahigh-resolution multicolor colocalization of single fluorescent probes, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 2000-08-15, עמ' 9461–9466 doi: 10.1073/pnas.170286097
^ Michael J. Rust, Mark Bates, Xiaowei Zhuang, Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) provides sub-diffraction-limit image resolution, Nature methods 3, 2006-10, עמ' 793–795 doi: 10.1038/nmeth929
^ Michael J. Rust, Mark Bates, Xiaowei Zhuang, Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) provides sub-diffraction-limit image resolution, Nature methods 3, 2006-10, עמ' 793–795 doi: 10.1038/nmeth929
^ ¹ ² Alexander Egner, Claudia Geisler, Claas von Middendorff, Hannes Bock, Fluorescence Nanoscopy in Whole Cells by Asynchronous Localization of Photoswitching Emitters, Biophysical Journal 93, 2007-11-01, עמ' 3285–3290 doi: 10.1529/biophysj.107.112201
^ Kasper, R.; B. Harke; C. Forthmann; P. Tinnefeld; S. W. Hell; M. Sauer, Single-Molecule STED Microscopy with Photostable Organic Fluorophores, M. Sauer
^ Schmidt R, Wurm CA, Jakobs S, Engelhardt J, Egner A, Hell SW. 2008;5:539–544., Spherical nanosized focal spot unravels the interior of cells. Nat. Methods., 2008
^ Bossi M, F¨olling J, Belov VN, Boyarskiy VP, Medda R, et al, Multicolor far-field fluorescence nanoscopy through isolated detection of distinct molecular species 8:2463–2468., Nano Lett, 2008
^ ] Westphal V, Rizzoli SO, Lauterbach MA, Kamin D, Jahn R, Hell SW, Video-rate far-field optical nanoscopy dissects synaptic vesicle movement, Science
^ Hari Shroff, Catherine G Galbraith, James A Galbraith, Eric Betzig, Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics, Nature methods 5, 2008-5, עמ' 417–423 doi: 10.1038/nmeth.1202
^ Manley S, Gillette JM, Patterson GH, Shroff H, Hess HF, et al, High-density mapping of singlemolecule trajectories with photoactivated localization microscopy., Nat. Methods
^ Bo Huang, Wenqin Wang, Mark Bates, Xiaowei Zhuang, Three-dimensional Super-resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, Science (New York, N.Y.) 319, 2008-02-08, עמ' 810–813 doi: 10.1126/science.1153529
^ Manuel F. Juette, Travis J. Gould, Mark D. Lessard, Michael J. Mlodzianoski, Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples, Nature Methods 5, June 2008, עמ' 527–529 doi: 10.1038/nmeth.1211
^ Michael J. Rust, Mark Bates, Xiaowei Zhuang, Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) provides sub-diffraction-limit image resolution, Nature methods 3, 2006-10, עמ' 793–795 doi: 10.1038/nmeth929
^ W. Mark Bates, Bo Huang, Graham T. Dempsey, Xiaowei Zhuang, Multicolor Super-resolution Imaging with Photo-switchable Fluorescent Probes, Science (New York, N.Y.) 317, 2007-09-21, עמ' 1749–1753 doi: 10.1126/science.1146598
^ Betzig E, Patterson GH, Sougrat R, Lindwasser OW, Olenych S., Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science., et al
^ W. Mark Bates, Bo Huang, Graham T. Dempsey, Xiaowei Zhuang, Multicolor Super-resolution Imaging with Photo-switchable Fluorescent Probes, Science (New York, N.Y.) 317, 2007-09-21, עמ' 1749–1753 doi: 10.1126/science.1146598
^ Roman Schmidt, Christian A. Wurm, Stefan Jakobs, Johann Engelhardt, Spherical nanosized focal spot unravels the interior of cells, Nature Methods 5, June 2008, עמ' 539–544 doi: 10.1038/nmeth.1214

[1] Larry H. Bernstein, MD, FCAP, Development Of Super-Resolved Fluorescence Microscopy, pharmaceuticalintelligence.com, ‏October 12, 2014

[2] Hell SW, Wichmann J., Breaking the diffraction resolution limit by stimulated-emission, Opt. Lett., 1994

[3] Klar TA, Hell SW, Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy, Opt. Lett

[4] Mats G. L. Gustafsson, Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 2005-09-13, עמ' 13081–13086 doi: 10.1073/pnas.0406877102

[5] Super-Resolution Optical Microscopy – Ultrafast and Microspectroscopy Laboratories, uml.chemistry.unimelb.edu.au (באנגלית אמריקאית)

[6] Russell E Thompson, Daniel R Larson, Watt W Webb, Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes., Biophysical Journal 82, 2002-5, עמ' 2775–2783 doi: 10.1016/S0006-3495(02)75618-X

[7] R N Ghosh, W W Webb, Automated detection and tracking of individual and clustered cell surface low density lipoprotein receptor molecules., Biophysical Journal 66, May 1994, עמ' 1301–1318 doi: 10.1016/S0006-3495(94)80939-7

[8] Elio A. Abbondanzieri, William J. Greenleaf, Joshua W. Shaevitz, Robert Landick, Direct observation of base-pair stepping by RNA polymerase, Nature 438, 2005-11-24, עמ' 460–465 doi: 10.1038/nature04268

[9] Thilo D. Lacoste, Xavier Michalet, Fabien Pinaud, Daniel S. Chemla, Ultrahigh-resolution multicolor colocalization of single fluorescent probes, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 2000-08-15, עמ' 9461–9466 doi: 10.1073/pnas.170286097

[10] Michael J. Rust, Mark Bates, Xiaowei Zhuang, Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) provides sub-diffraction-limit image resolution, Nature methods 3, 2006-10, עמ' 793–795 doi: 10.1038/nmeth929

[11] Michael J. Rust, Mark Bates, Xiaowei Zhuang, Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) provides sub-diffraction-limit image resolution, Nature methods 3, 2006-10, עמ' 793–795 doi: 10.1038/nmeth929

[:0-12] ¹ ² Alexander Egner, Claudia Geisler, Claas von Middendorff, Hannes Bock, Fluorescence Nanoscopy in Whole Cells by Asynchronous Localization of Photoswitching Emitters, Biophysical Journal 93, 2007-11-01, עמ' 3285–3290 doi: 10.1529/biophysj.107.112201

[13] Kasper, R.; B. Harke; C. Forthmann; P. Tinnefeld; S. W. Hell; M. Sauer, Single-Molecule STED Microscopy with Photostable Organic Fluorophores, M. Sauer

[14] Schmidt R, Wurm CA, Jakobs S, Engelhardt J, Egner A, Hell SW. 2008;5:539–544., Spherical nanosized focal spot unravels the interior of cells. Nat. Methods., 2008

[15] Bossi M, F¨olling J, Belov VN, Boyarskiy VP, Medda R, et al, Multicolor far-field fluorescence nanoscopy through isolated detection of distinct molecular species 8:2463–2468., Nano Lett, 2008

[16] ] Westphal V, Rizzoli SO, Lauterbach MA, Kamin D, Jahn R, Hell SW, Video-rate far-field optical nanoscopy dissects synaptic vesicle movement, Science

[17] Hari Shroff, Catherine G Galbraith, James A Galbraith, Eric Betzig, Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics, Nature methods 5, 2008-5, עמ' 417–423 doi: 10.1038/nmeth.1202

[18] Manley S, Gillette JM, Patterson GH, Shroff H, Hess HF, et al, High-density mapping of singlemolecule trajectories with photoactivated localization microscopy., Nat. Methods

[19] Bo Huang, Wenqin Wang, Mark Bates, Xiaowei Zhuang, Three-dimensional Super-resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, Science (New York, N.Y.) 319, 2008-02-08, עמ' 810–813 doi: 10.1126/science.1153529

[20] Manuel F. Juette, Travis J. Gould, Mark D. Lessard, Michael J. Mlodzianoski, Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples, Nature Methods 5, June 2008, עמ' 527–529 doi: 10.1038/nmeth.1211

[21] Michael J. Rust, Mark Bates, Xiaowei Zhuang, Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) provides sub-diffraction-limit image resolution, Nature methods 3, 2006-10, עמ' 793–795 doi: 10.1038/nmeth929

[22] W. Mark Bates, Bo Huang, Graham T. Dempsey, Xiaowei Zhuang, Multicolor Super-resolution Imaging with Photo-switchable Fluorescent Probes, Science (New York, N.Y.) 317, 2007-09-21, עמ' 1749–1753 doi: 10.1126/science.1146598

[23] Betzig E, Patterson GH, Sougrat R, Lindwasser OW, Olenych S., Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science., et al

[24] W. Mark Bates, Bo Huang, Graham T. Dempsey, Xiaowei Zhuang, Multicolor Super-resolution Imaging with Photo-switchable Fluorescent Probes, Science (New York, N.Y.) 317, 2007-09-21, עמ' 1749–1753 doi: 10.1126/science.1146598

[25] Roman Schmidt, Christian A. Wurm, Stefan Jakobs, Johann Engelhardt, Spherical nanosized focal spot unravels the interior of cells, Nature Methods 5, June 2008, עמ' 539–544 doi: 10.1038/nmeth.1214

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]

[15]

[16]

[17]

[18]

[19]

[20]

[21]

[22]

[23]

[24]

[25]

@@ שורה 41: / שורה 41: @@
 מבנה ביולוגי מוגדר על ידי מיקום המולקולת המרכיבות את המבנה. באופן דומה, תמונה פלואורסצנטית מוגדרת על ידי הקואורדינטות המרחביות של הפלואורופורים היוצרים את התמונה. אפשר לנצל זאת, ועל ידי מציאת מיקום הזהירה במדגם ברמת דיוק גבוהה ניתן להגיע לרזולוציית-על. למרות שהתמונה המתקבלת מפלואורופור בודד היא נקודה בגודל סופי, קביעת מיקום הפלואורופור מהתמונה המתקבלת יכולה להיות מדוייקת הרבה יותר מגבול הדיפרקציה, כל עוד התמונה מתקבלת ממספר רב של פוטונים אשר נפלטים מהפלואורופור. אפשר להתייחס להרכבת תמונה בעזרת N פוטונים כאל מדידת מיקומם של N פלואורופורים, עם אי ודאות המוערך ע"י <ref>{{צ-מאמר|מחבר=Russell E Thompson, Daniel R Larson, Watt W Webb|שם=Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.|כתב עת=Biophysical Journal|כרך=82|עמ=2775–2783|שנת הוצאה=2002-5|doi=10.1016/S0006-3495(02)75618-X|קישור=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1302065/}}</ref> Δloc≈ Δ/√N כאשר Δloc הוא אי ודאות המיקום, וΔ הוא אי ודאות של מדידת מיקום בודדת. קנה מידה זה מאפשר מיקרוסקופייה ברזולוציית על, אשר לא מוגבלת על ידי דיפרקציית האור. מדידה בדיוק גבוה של מקורות אור, כמו חלקיקים פלואורוצנטים, נפוצה בניסויים ביופיסיקליים <ref>{{צ-מאמר|מחבר=R N Ghosh, W W Webb|שם=Automated detection and tracking of individual and clustered cell surface low density lipoprotein receptor molecules.|כתב עת=Biophysical Journal|כרך=66|עמ=1301–1318|שנת הוצאה=May 1994|doi=10.1016/S0006-3495(94)80939-7|קישור=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1275851/}}</ref>, והגיע לרמת דיוק שקרובה ל 1Å <ref>{{צ-מאמר|מחבר=Elio A. Abbondanzieri, William J. Greenleaf, Joshua W. Shaevitz, Robert Landick|שם=Direct observation of base-pair stepping by RNA polymerase|כתב עת=Nature|כרך=438|עמ=460–465|שנת הוצאה=2005-11-24|doi=10.1038/nature04268|קישור=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1356566/}}</ref>([[אנגסטרום]]).
-על ידי זיהוי והדמייה של מולקולה בודדת, הצליחו להגיע בניסויים לרמת דיוק של ננומטרים בודדים. עם זאת, נוצרת בעיה כאשר מספר מולקולת נמצאות בסמיכות, ורמת הדיוק יורדת בצורה דרסטית, כיוון שהתמונות המתקבלות מהפלואורופורים חופפות. ניתן להפריד את האותות המתקבלים ממולקולות בעלי תמונה חופפת על ידי ניתוח [[ספקטרום בליעה|ספקטרום הבליעה]] ו[[ספקטרום פליטה|הפליטה]] הייחודי לכל מולקולה <ref>{{צ-מאמר|מחבר=Thilo D. Lacoste, Xavier Michalet, Fabien Pinaud, Daniel S. Chemla|שם=Ultrahigh-resolution multicolor colocalization of single fluorescent probes|כתב עת=Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America|כרך=97|עמ=9461–9466|שנת הוצאה=2000-08-15|doi=10.1073/pnas.170286097|קישור=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC16886/}}</ref>, הפרדה בזמן, ומספר שיטות נוספות .עם זאת, מסובך יותר להגיע לרמות דיוק גבוהות יותר המוגבלות על ידי דיפרקציית האור בעזרת שיטות אלו.
+על ידי זיהוי והדמייה של מולקולה בודדת, הצליחו להגיע בניסויים לרמת דיוק של ננומטרים בודדים. עם זאת, נוצרת בעיה כאשר מספר מולקולת נמצאות בסמיכות, ורמת הדיוק יורדת בצורה דרסטית, כיוון שהתמונות המתקבלות מהפלואורופורים חופפות. ניתן להפריד את האותות המתקבלים ממולקולות בעלי תמונה חופפת על ידי ניתוח [[ספקטרום בליעה|ספקטרום הבליעה]] ו[[ספקטרום פליטה|הפליטה]] הייחודי לכל מולקולה <ref>{{צ-מאמר|מחבר=Thilo D. Lacoste, Xavier Michalet, Fabien Pinaud, Daniel S. Chemla|שם=Ultrahigh-resolution multicolor colocalization of single fluorescent probes|כתב עת=Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America|כרך=97|עמ=9461–9466|שנת הוצאה=2000-08-15|doi=10.1073/pnas.170286097|קישור=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC16886/}}</ref>, הפרדה בזמן, ומספר שיטות נוספות .עם זאת, מסובך יותר להגיע לרמות דיוק גבוהות יותר המוגבלות על ידי דיפרקציית האור בעזרת שיטות אלו.  [[קובץ:Label-free Localisation Microscopy SPDM - Super Resolution Microscopy Christoph Cremer.jpg|ממוזער|הדגמת השימוש בשיטת מיקום המולקולה היחידה, לגילוי מבנים תת-תאיים]]דגימה ביולוגית-פלואורוצנטית אופיינת מכילה אלפי, או אפילו מיליונים פלואורופורים בצפיפות גבוהה, דבר המקשה על קבלת תמונה ברורה בשיטת הSMLM. על ידי שימוש בגשושיות פלואורוצנטיות הניתנות לשליטה (photoswitchable probes), היכולות להחליף בין מצב חשוך למצב פולט אור, אפשר לחלק את תמונת הזהירה המתקבלת לתחומי זמן שונים, כך בעיית התמונה החופפת שמתקבלת ממולקולות שונות ניתנת לפיתרון. בשיטה זו, מולקולות הנמצאות בתחומי דיפרקציית האור יכולות להיות להיות "מצולמות" בנקודות זמן שונות, כך שעבור מולקולות חופפות, ניתן לצלם מולקולה מסויימת, לאחר מכן "לכבות" את המולקולה ולצלם את המולקולה הבאה, כך שהתמונה הכוללת המתקבלת כבר לא תהיה מוגבלת על ידי החפיפה. מיקום מקבילי מושג על ידי [[הדמיית שדה רחב]], כך שקואורדינטות הפלואורופורים ממופות, ונבנית תמונה ברזולוציית על. שיטה זו תוכננה ויושמה באופן עצמאי על ידי שלוש מעבדות, והיא קיבלה את השמות STORM PALM  ו- FPALM בהתאמה. שלושת המעבדות השתמשו בתחילה בצבעים פלואורסצנטיים או [[חלבון|חלבונים]] שיכולים להיות מופעלים על ידי אור באורך גל שונה מאור ההדמיה ,המעורר את זהירתם ומנטרל את הפלואורופורים. הפרדה זאת מאפשרת שליטה על כמות המולקולות הנמצאות במצב פלואורסצנטי מסויים בזמן נתון, כך שהמולקולות המופעלות ניתנות להפרדה ומיקומם מתקבל. חזרה על התהליך מאפשר למפות את מיקומי הפלואורופורים בדיוק רב, ולקבל תמונה ברזולוציית על.
-[[קובץ:3D-SIM-4 Anaphase 3 color.jpg|ממוזער|הדמייה תלת ממדית בשיטת SIM של תא של עכבר [[מיטוזה|בטלופאזה]]]]
-דגימה ביולוגית-פלואורוצנטית אופיינת מכילה אלפי, או אפילו מיליונים פלואורופורים בצפיפות גבוהה, דבר המקשה על קבלת תמונה ברורה בשיטת הSMLM. על ידי שימוש בגשושיות פלואורוצנטיות הניתנות לשליטה (photoswitchable probes), היכולות להחליף בין מצב חשוך למצב פולט אור, אפשר לחלק את תמונת הזהירה המתקבלת לתחומי זמן שונים, כך בעיית התמונה החופפת שמתקבלת ממולקולות שונות ניתנת לפיתרון. בשיטה זו, מולקולות הנמצאות בתחומי דיפרקציית האור יכולות להיות להיות "מצולמות" בנקודות זמן שונות, כך שעבור מולקולות חופפות, ניתן לצלם מולקולה מסויימת, לאחר מכן "לכבות" את המולקולה ולצלם את המולקולה הבאה, כך שהתמונה הכוללת המתקבלת כבר לא תהיה מוגבלת על ידי החפיפה. מיקום מקבילי מושג על ידי [[הדמיית שדה רחב]], כך שקואורדינטות הפלואורופורים ממופות, ונבנית תמונה ברזולוציית על. שיטה זו תוכננה ויושמה באופן עצמאי על ידי שלוש מעבדות, והיא קיבלה את השמות STORM PALM  ו- FPALM בהתאמה. שלושת המעבדות השתמשו בתחילה בצבעים פלואורסצנטיים או [[חלבון|חלבונים]] שיכולים להיות מופעלים על ידי אור באורך גל שונה מאור ההדמיה ,המעורר את זהירתם ומנטרל את הפלואורופורים. הפרדה זאת מאפשרת שליטה על כמות המולקולות הנמצאות במצב פלואורסצנטי מסויים בזמן נתון, כך שהמולקולות המופעלות ניתנות להפרדה ומיקומם מתקבל. חזרה על התהליך מאפשר למפות את מיקומי הפלואורופורים בדיוק רב, ולקבל תמונה ברזולוציית על.
 המאפיינים הפיזיים והכימיים של הגשושיות הפלואורצנטיות קריטיים לקבלת תמונה ברזולציית על בשיטת הSMLM. עד כה נעשה שימוש במספר גדול של פלואורופורים הניתנים לשליטה על ידי אותות אופטיים. הגשושיות הללו יכולות להיות עשויות ממגוון רחב של חומרים, החל מצבעים אורגנים עד ל[[חלבון פלואורסצנטי ירוק|חלבונים פלואורוסנטים]], המאפשרות סיווג של דגימות ביולוגיות בעזרת מגוון של שיטות. הרזולוציה של טכניקה זו מוגבלת על ידי מספר הפוטונים שנקלטו בכל אירוע של פליטת אור מהגשושיות, אשר משתנה ממאות עבור חלבונים פלואורוצנטים, עד אלפים עבור צבעים אורגניים מסוג [[ציאנין]], כגון Cy5 <ref>{{צ-מאמר|מחבר=Michael J. Rust, Mark Bates, Xiaowei Zhuang|שם=Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) provides sub-diffraction-limit image resolution|כתב עת=Nature methods|כרך=3|עמ=793–795|שנת הוצאה=2006-10|doi=10.1038/nmeth929|קישור=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2700296/}}</ref>. מספרים אלה מאפשרים שיפור של יותר מסדר גודל אחד ברזולוצייה המרחבית של המיקרוסקופ. בפועל, חוקרים  הצליחה להגיעה לרזולוציה רוחבית של 20 ננומטר באמצעות שימוש בגשושיות ציאנין <ref>{{צ-מאמר|מחבר=Michael J. Rust, Mark Bates, Xiaowei Zhuang|שם=Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) provides sub-diffraction-limit image resolution|כתב עת=Nature methods|כרך=3|עמ=793–795|שנת הוצאה=2006-10|doi=10.1038/nmeth929|קישור=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2700296/}}</ref>. שיטה זו אפשרה להגיע לרזולוציות גבוהות בחקר מבנה ה[[DNA]] ומבנה החלבונים השונים המרכיבים אותו, בנוסף למבנים תאיים אחרים<ref name=":0">{{צ-מאמר|מחבר=Alexander Egner, Claudia Geisler, Claas von Middendorff, Hannes Bock|שם=Fluorescence Nanoscopy in Whole Cells by Asynchronous Localization of Photoswitching Emitters|כתב עת=Biophysical Journal|כרך=93|עמ=3285–3290|שנת הוצאה=2007-11-01|doi=10.1529/biophysj.107.112201|קישור=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2025649/}}</ref>.
@@ שורה 50: / שורה 48: @@
 בשנים האחרונות נעשתה התקדמות בתחום של רזולוציית על, המאפשרת יישומים חדשים בדגימות ביולוגיות. ההתקדמות הטכנית הזו התאפשרה באמצעות פיתוח השיטות של הדמייה אופטית וגשושיות פלואורצנטיות.
+'''הדמייה מרובת צבעים:'''[[קובץ:GFP Superresolution Christoph Cremer.JPG|ממוזער|הדמייה דו-צבעית בשיטת הSMLM של [[חלבון כימרי|חלבונים כימריים]] מסוג GFP & RFP.]]
-'''הדמייה מרובת צבעים:'''
 קבלת תמונה של מבנה ביולוגי חשובה על מנת להבין את את הפונקציונליות שלו, אך אין זה תמיד מספיק כיוון שתהליכים ביולוגיים רבים מעורבים באינטראקציות בין מבנים ותתי מבנים שונים. אחת מהדרכים להתמודד עם אינטראקציות אלה היא באמצעות שימוש במיקרוסקופיה מרובת צבעים, בה מרכיבים שונים במבנה מסומנים בצבעים שונים. הצבעים השונים בתמונה משמשים כאינדיקטורים לאינטראקציות אפשריות, אך רמת הדיוק בשיטה זו מוגבלת על ידי הרזולוצייה של שיטת ההדמייה. הדמייה מרובת צבעים ברזולוציית על מאפשרת לקדם באופן ניכר את ההבנה של אינטראקציות מולקולריות בתאים.
+הדמיה מרובת צבעית בשיטת תבנית העירור המרחבית:
-הדמיה מרובת צבעית בשיטת תבנית העירור המרחבית:[[קובץ:Label-free Localisation Microscopy SPDM - Super Resolution Microscopy Christoph Cremer.jpg|ממוזער|הדגמת השימוש בשיטת מיקום המולקולה היחידה, לגילוי מבנים תת-תאיים]]הדמייה מרובת צבעים בשיטת STED ניתנת לביצוע באמצעות פלואורופורים בעלי דרגת עירור ופליטת אורך גל שונה. על מנת לקבל הדמייה מרובת צבעים, יש להשתמש בלפחות שני סוגי פלואורופורים. באמצעות שימוש בזוג צבעים פלואורוסנטים ואלומות לייזר STED, ניתן לקבל הדמייה של [[קולוקליזציה]] (Colocalization) בין אשכולות ה[[שלפוחית סינפטית|חלבון הסינפטי]] וה[[מיטוכונדריון|מיטוכונדריה]], ברזולוציה שמגיעה ל 5 ננומטר <ref>{{צ-מאמר|מחבר=Kasper, R.; B. Harke; C. Forthmann; P. Tinnefeld; S. W. Hell; M. Sauer|שם=Single-Molecule STED Microscopy with Photostable Organic Fluorophores|כתב עת=M. Sauer}}</ref>. שימושים נוספים בשיטה זו איפשרו לדמות את [[קרום התא|קרום]] [[ממברנה ביולוגית|הממברנה]] החיצוני של המיטוכונדריה בשלושה מימדים<ref>{{צ-ספר|מחבר=Schmidt R, Wurm CA, Jakobs S, Engelhardt J, Egner A, Hell SW.  2008;5:539–544.|שם=Spherical nanosized focal spot unravels the interior of cells. Nat. Methods.|מו"ל=|שנת הוצאה=2008}}</ref>.
+הדמייה מרובת צבעים בשיטת STED ניתנת לביצוע באמצעות פלואורופורים בעלי דרגת עירור ופליטת אורך גל שונה. על מנת לקבל הדמייה מרובת צבעים, יש להשתמש בלפחות שני סוגי פלואורופורים. באמצעות שימוש בזוג צבעים פלואורוסנטים ואלומות לייזר STED, ניתן לקבל הדמייה של [[קולוקליזציה]] (Colocalization) בין אשכולות ה[[שלפוחית סינפטית|חלבון הסינפטי]] וה[[מיטוכונדריון|מיטוכונדריה]], ברזולוציה שמגיעה ל 5 ננומטר <ref>{{צ-מאמר|מחבר=Kasper, R.; B. Harke; C. Forthmann; P. Tinnefeld; S. W. Hell; M. Sauer|שם=Single-Molecule STED Microscopy with Photostable Organic Fluorophores|כתב עת=M. Sauer}}</ref>. שימושים נוספים בשיטה זו איפשרו לדמות את [[קרום התא|קרום]] [[ממברנה ביולוגית|הממברנה]] החיצוני של המיטוכונדריה בשלושה מימדים<ref>{{צ-ספר|מחבר=Schmidt R, Wurm CA, Jakobs S, Engelhardt J, Egner A, Hell SW.  2008;5:539–544.|שם=Spherical nanosized focal spot unravels the interior of cells. Nat. Methods.|מו"ל=|שנת הוצאה=2008}}</ref>.
 הדמיה מרובת צבעית בשיטת הSMLM:
 המפתח להדמיה רב צבעית בשיטת מיקום מולקולה יחידה היא להבדיל בין התכונות של כל אחת מהגשושיות הפלואורסנטיות. מלבד פליטה של גל כתוצאה מעירור, אורך הגל המשמש להפעלה יכול לשמש כחתימה של הפלואורופורים. לכן הדרישה המוקדמת של הדמייה בשיטה זו היא שהגשושיות הפלואוסנטיות הניתנות לשליטה יהיו בעלי אורכי גל שונים עבור עירור, פליטה או הפעלה, דבר המאפשר הבדלה ביניהם. גשושיות אלו נוצרו על בסיס צבעים אורגנים-פלואורוסנטים מסוג ציאנין. הגשושיות מורכבות מפלואורופור "מדווח", שיכול להפוך לחשוך כאשר מעורר על ידי אור ההדמיה, ופלואורופור "מפעיל", אשר מאפשר את ההפעלה של הפלואורופור ה"מדווח" כאשר מואר על ידי אור באור גל מתאים. צבעי ציאנין בתחומים שונים החל מאדום כהה עד אינפרא-אדום, מתפקדים כ"מדווחים" הניתנים לשליטה, וגם לצבעי הציאנין עבור ה"מפעילים" יש מגוון רחב של אפשרויות, החל מסגול ועד צהוב. שילוב של "המדווחים" וה"מפעילים" יוצר מגוון רחב של גשושיות פלואורצנטיות הנבדלות באורכי גל ההפעלה והפליטה. הדמיה תלת-צבעית של מולקולות DNA, הדמיה דו-צבעית של [[שלד התא|מיקרוטובולים]] בתאים והדמיה דו-צבעית תלת-ממדית של מיקרוטובלים ומיטוכונדריה הושגו באמצעות שיטה זו <ref>{{צ-ספר|מחבר=Bossi M, F¨olling J, Belov VN, Boyarskiy VP, Medda R, et al|שם=Multicolor far-field fluorescence nanoscopy through isolated detection of distinct molecular species 8:2463–2468.|מו"ל=Nano Lett|שנת הוצאה=2008}}</ref>
-[[קובץ:GFP Superresolution Christoph Cremer.JPG|ממוזער|הדמייה דו-צבעית בשיטת הSMLM של [[חלבון כימרי|חלבונים כימריים]] מסוג GFP & RFP.]]
+'''הדמיית תאים חיים:'''[[קובץ:3D-SIM-4 Anaphase 3 color.jpg|ממוזער|הדמייה תלת ממדית בשיטת SIM של תא של עכבר [[מיטוזה|בטלופאזה]]]]אחד מהייתרונות של מיקרוסקופיית אור הוא היכולת ליצור הדמייה של תאים חיים. ישנן שתי דרישות עיקריות על מנת לערוך הדמיית תאים חיים: יש לסווג את התאים,  ולוודא שרזולוציית הזמן גבוהה מספיק כדי לעקוב אחרי התנועות בתא. השיטות ברזולוציית על שיושמו עד כה, כולללות, את שיטת תבנית העירור המרחבית ושיטת מיקום המולקולה היחידה. שתי שיטות ההדמייה איטיות באופן יחסי. האחרונה כרוכה בהכנסת גשושיות הניתנות לשליטה באמצעות אותות אופטיים לתאים חיים, מה שמוסיף אתגר נוסף. עם זאת, מספר רב של חומרים התגלו כניתנים לשליטה על ידי אותות אופטיים.
-'''הדמיית תאים חיים:'''
-אחד מהייתרונות של מיקרוסקופיית אור הוא היכולת ליצור הדמייה של תאים חיים. ישנן שתי דרישות עיקריות על מנת לערוך הדמיית תאים חיים: יש לסווג את התאים,  ולוודא שרזולוציית הזמן גבוהה מספיק כדי לעקוב אחרי התנועות בתא. השיטות ברזולוציית על שיושמו עד כה, כולללות, את שיטת תבנית העירור המרחבית ושיטת מיקום המולקולה היחידה. שתי שיטות ההדמייה איטיות באופן יחסי. האחרונה כרוכה בהכנסת גשושיות הניתנות לשליטה באמצעות אותות אופטיים לתאים חיים, מה שמוסיף אתגר נוסף. עם זאת, מספר רב של חומרים התגלו כניתנים לשליטה על ידי אותות אופטיים.
 הדמיית תאים חיים בעזרת שיטת תבנית העירור המרחבית:
@@ שורה 74: / שורה 71: @@
  גשושיות פלואורסצנטיות יכולות להקל מאוד על מעקב אחר החלקיקים. בניגוד לניסויים קונבנציונאלים של מעקב אחרי חלקיק יחיד, שבו מתבצע סיווג ומעקב רק אחר חלק קטן של המטרות, השימוש בגשושיות הפלואורסצנטיות מאפשרות לעקוב אחר מטרות בצפיפות גבוהה יותר. למרות שניתן להפעיל את הגשושיות רק בחלק קטן של המבנים בזמן נתון,  לאחר מחזורי פעולה רבים מתקבלת מפה מפורטת של מסלולי החלקיקים. גישה זו שימשה לבדיקת קיומם של מיקרו-מבנים בממברנה על ידי בחינת תכונות המפה המרחבית של החלבונים בממברנה<ref>{{צ-מאמר|מחבר=Manley S, Gillette JM, Patterson GH, Shroff H, Hess HF, et al|שם=High-density mapping of singlemolecule trajectories with photoactivated localization microscopy.|כתב עת=Nat. Methods}}</ref>.
+'''הדמייה תלת מימדית:'''
+[[קובץ:3D-SIM-2 Nucleus prophase 3d rotated.jpg|ממוזער|הדמייה תל מימדית בשיטת SIM של גרעין התא ב[[פרופאזה]] מזוויות שונות]]
+מרבית המבנים התאיים הם תלת מימדיים מטבעם, והיכולת לפענח מבנה תלת מימדי מוגבלת על ידי המימד בעל הרזולוצייה הנמוכה ביותר. מכאן נבע הצורך לפתח שיטות המאפשרות קבלת רזולציית על בשלושה מימדית.
+הדמיה תלת מימדית בשיטת הSMLM זו יושמה לראשונה באמצעות שיטת [[אסטיגמציה]] למיקום הצירים <ref>{{צ-מאמר|מחבר=Bo Huang, Wenqin Wang, Mark Bates, Xiaowei Zhuang|שם=Three-dimensional Super-resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy|כתב עת=Science (New York, N.Y.)|כרך=319|עמ=810–813|שנת הוצאה=2008-02-08|doi=10.1126/science.1153529|קישור=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2633023/}}</ref>. בשיטה זו מוכנסת למכשיר עדשה גלילית, המאפשרת פוקוס שונה בכיווני x ו- y. כתוצאה מכך, התמונה המתקבלת מפלורופור יחיד הופכת לאליפטית, דבר המאפשר מדידה בו זמנית של המיקום הצירי (ציר Z) שלה מ[[פחיסות]] האליפסה, ואת המיקום הרוחבי (ציר מישור XY) ממרכז התמונה .שיטה זו הגיעה לדיוק רוחבי של ~ 25 ננומטר ודיוק צירי של ~ 50 ננומטר.  תיאור מלא של מבנים ביולוגים, לדוגמא הדמייה מלאה של תאי יונקים, הושגו באמצעות שיטה זו .
+יישום נוסף של הדמיה תלת מימדית נעשה על ידי הדמייה בשני מישורים שונים, בהם האור הנפלט מהדגימה מפוצל ומגיע לאזורים שונים במצלמה. אורכי הדרכים השונות בהם עבר האור מאפשרים לקבוע את הקואורדינטות בציר Z, ובכך לקבל תמונה תלת מימדית <ref>{{צ-מאמר|מחבר=Manuel F. Juette, Travis J. Gould, Mark D. Lessard, Michael J. Mlodzianoski|שם=Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples|כתב עת=Nature Methods|כרך=5|עמ=527–529|שנת הוצאה=June 2008|doi=10.1038/nmeth.1211|קישור=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18469823}}</ref>.
 == רמת הדיוק של מיקרוסקופייה ברזולוציית על ==